[发明专利]一步法构建携带外源基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物基因技术领域，涉及基因的构建和应用，具体涉及到一步法构建携带外源基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体及其应用。 

背景技术

目前已经证明，肿瘤形成的分子和细胞病变过程是由基因突变所致，因而从理论上讲，针对肿瘤病理的不同阶段及不同特性设计基因治疗是可行的。目前，基因治疗主要应用病毒载体和非病毒载体。由于非病毒载体转染效率较低，故目前大多数的基因治疗使用病毒载体介导。 

腺病毒载体用于基因治疗领域具有多方面的优势，如：感染细胞类型广，感染率高；理化性质稳定，容易制备高滴度病毒；不整合入细胞基因组，遗传毒性较低；安全性好等。之前的研究结果显示，通过腺病毒携带治疗基因将大幅度提升腺病毒对于肿瘤细胞的杀伤能力。然而，构建携带外源基因的溶瘤腺病毒载体的过程非常复杂，并且需要耗费大量的时间。因此，有必要构建一种通用型的腺病毒载体骨架，使其只需通过一步酶切连接就可实现将外源基因插入到腺病毒骨架载体中。 

发明内容

本发明的目的在于，提供一种一步法构建的携带外源基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体，在Ad5 D24条件复制型腺病毒载体基础上，经过以下两方面的改造以提高这类载体插入外源基因的构建效率：(1)突变腺病毒基因组上的BamHI位点；(2)通过同源重组的方法在fiber和E4之间引入BamHI和SfuI，从而可以通过酶切连接的方法一步将外源基因引入腺病毒基因组中。得到的携带外源基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体，可用于制备治疗肿瘤药物中的应用。 

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术方案： 

一种一步法构建的携带外源基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体，其特征在于，重组腺病毒载体Ad5 E1A中的24bp碱基缺失，该类型重组腺病毒载体可以在pRBnull/mutant的肿瘤细胞中特异性复制；采用同源重组的方法将Ad5腺病毒基因组位于Hexon上第21468bp～21573bp的BamHI进行突变；在Ad5腺病毒基因组第31042bp处插入的修饰纤 维蛋白为5/3，5/6，5/7，5/11，5/35序列中的任意一个；在Ad5腺病毒基因组fiber和E4之间即在Ad5腺病毒基因组第32788bp～32913bp处引入两个单一的酶切位点BamHI、SfuI，在Ad5腺病毒基因组引入的两个单一酶切位点之间插入一个用于筛选的表达元件；在Ad5腺病毒基因组引入的两个单一酶切位点之间插入双向表达框，该双向表达框携带一个报告基因和一个治疗基因，得到携带外源基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体。 

上述24bp碱基缺失的位置在腺病毒基因组的第922bp～947bp，碱基缺失序列为cttacctgccacgaggctggcttt。 

上述筛选的表达元件是用于蓝白斑筛选的β-半乳糖苷酶基因表达元件，在细菌中表达的用于筛选的荧光蛋白表达元件、氨苄青霉素表达元件、卡那霉素表达元件、氯霉素表达元件中的任意一种。 

上述的报告基因是绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、荧光素酶、β-半乳糖苷酶基因中的任意一种。

上述的治疗基因是TRAIL，IL-24，IL-12，IFN，p53，arresten，endostatin等中的任意一种。 

上述一步法构建的携带外源基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体，具体按下述步骤构建： 

(1)用酶切连接的方法构建Ad5 E1A分子中24个碱基缺失的穿梭载体： 

以Ad5基因组质粒为模板，经过重叠聚合酶链式反应获得含有Ad5 E1A分子中24bp碱基缺失的基因片段。将聚合酶链式反应片段与pGEMT-T easy载体连接，将连接产物转化DH5α细胞，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定阳性克隆。将所获得阳性克隆命名为pGEMT/Ad5-D24F。 

将Ad5-D24F片段从pGEMT/Ad5-D24F上经PacI和SpeI双酶切下来，与用PacI和SpeI双酶切处理的腺病毒E1穿梭载体进行连接。连接产物转化DH5α细胞、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，命名为pHBD24 shuttle，此载体为获得的pAd5 E1A 24bp缺失的穿梭载体。 

(2)构建pHBD24-backbone：