[发明专利]重要呼吸道致病病毒检测基因芯片的制备和用途

说明书

技术领域

本发明涉及九种常见呼吸道致病病毒检测基因芯片的制备和用途，属基因芯片检测技术领域。

背景技术

呼吸道病毒是指一大类能侵犯呼吸道引起呼吸道局部病变或仅以呼吸道为入侵门户，主要引起呼吸道外组织器官病变的病毒。目前至少有7个病毒科的10多个属共239个型别的病毒可引起急性呼吸道感染。急性呼吸道感染是临床常见病之一，已成为严重威胁人类健康的一个公共卫生问题。据世界卫生组织2002年统计报告，急性呼吸道感染居全球十大死亡原因中第3位，全球每年近四百万人死于急性呼吸道感染。在儿童和成人中，90％以上的急性呼吸道感染都是由病毒引起的。最常见的呼吸道病毒有甲乙型流感病毒(influenza virus)，1、2、3型副流感病毒(HPIV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、人偏肺病毒(hMPV)、麻疹病毒(Measlesvirus)、腮腺炎病毒(Mumps virus)、风疹病毒(Rubella virus)等。这些病毒具有感染力强、传播快、潜伏期短、发病急等特点。感染后因病毒型别种类繁多且其症状相似，如鼻炎、流涕、鼻塞、咳嗽、轻度咽炎、全身发热等症状，因此临床上很难鉴别。

及时准确的甄别病毒型别是临床诊治和疾病监控的关键环节。传统的呼吸道病毒实验室检测方法包括：组织细胞培养法；血清学和直接检测法(包括电镜法)；间接、直接免疫荧光抗体法(IFA/DFA)；酶免疫测定(EIA)、酶活性测定(神经氨酸酶测定)；核酸扩增法(PCR)。病毒的分离培养与鉴定及血清学实验等传统实验技术，在病毒性疾病诊断中曾起着十分重要的作用。组织细胞培养仍然是发现新病毒的重要技术手段，是其他任何技术不可替代的。然而，这些技术都还存在一些无法弥补的缺陷，操作费时、费力、敏感性差、诊断效率低等。总之，传统的实验室诊断方法和目前应用的实验技术，远远不能满足临床诊断的需要，医生单凭自己的临床经验进行病毒性疾病诊断的事是经常发生的。据此，病毒性疾病的实验室诊断技术必须改革，要寻找和建立快速、特异、敏感和简便的实验技术，以适应临床工作的需要。

基因芯片技术是20世纪90年代初发展起来的一种用于基因分析的高新生物技术，广泛用于临床疾病的研究，特别是用于诊断一些微生物病原体的感染。与传统的分子生物学技术相比，基因芯片技术其突出的特点是高通量、集成化、微型化、自动化等。特别适合于对大量未知样品进行平行快速高通量的分析。病毒的基因组较简单，每种病毒只有一种核酸，但是病毒增殖速度极快，故病毒较其他微生物更具有遗传不稳定性，即变异性。国内外文献专利报道的基因芯片技术用于检测呼吸道病毒的方法，多为随机引物结合基因芯片方法。虽然随机PCR扩增法的检测范围有了很大的改观，但该法扩增的靶基因用于芯片杂交，其杂交信号特异性差，国内相关的研究包括杨银辉等制备的cDNA探针基因芯片，可成功检测SARS病毒、东方马脑炎病毒等10种烈性RNA病毒，其敏感性为10²拷贝数，但特异性较差，与其他属的探针之间有非特异性杂交；黄岩山等建立了能检测十几种呼吸道病毒的基因芯片，种特异性探针长60mer，样品扩增采用随机接头PCR方法，使用该芯片可以成功检测细胞培养的甲型和乙型流感病毒，但是特异性和灵敏度均不高，由于所用引物在扩增时没有特异性，也必然导致扩增效率低，因此检测灵敏度也相应会下降。

荧光检测法是基因芯片的常规检测方法，即将荧光色素化合物直接或间接标记在待检核酸上，产生的荧光信号采用激光共聚焦扫描检测。该方法的缺点：荧光信号易饱和，易淬灭；存在自发荧光现象；而且更重要的是检测仪器价格昂贵，体积笨重，从而严重限制了基因芯片在国内的推广应用，尤其是在中小医疗机构以及现场检测的推广应用。开发成本低廉、检测方便、适合现场检测的基因芯片检测新技术势在必行。

金标银染技术(GLSS)的出现弥补了荧光检测法的不足，使基因芯片可视化检测成为可能。该技术的原理是首先用纳米金标记待检的PCR产物，然后在体系中引入银离子。小尺寸效应使纳米金具有很强的催化还原作用，可以将周围的银离子还原成银颗粒；而这些银颗粒又可以进一步催化还原周围的银离子。这种级联瀑布催化作用使得银颗粒越聚越多，紧紧包裹纳米金颗粒积聚成团状银壳，形成肉眼可见的黑色颗粒，肉眼即可观测。