[发明专利]一种检测新鲜烟叶中次生代谢物的衍生化GC-MS方法

权利要求书

1.一种检测新鲜烟叶中次生代谢物的衍生化GC-MS方法，其特征在于：快速采集新鲜烟叶并用液氮现场进行速冻，采用冷冻干燥方法除去水分后对烟叶进行粉碎，用溶剂超声提取烟粉中次生代谢物，对提取液上清液进行干燥，然后对干燥后提取物进行肟化反应、硅烷衍生化反应，最后采用GC-MS进行分析。

2.根据权利要求1所述的检测新鲜烟叶中次生代谢物的衍生化GC-MS方法，其特征在于：具体步骤如下：

(1) 烟叶的采集、处理、干燥、粉碎：快速采摘烟株指定部位烟叶，用液氮迅速冷冻以终止生命过程，冷冻干燥24h以除去烟叶水分，干燥过的烟叶粉碎至40-60目，放于-20℃冰箱保存；

(2) 烟叶中次生代谢物的萃取：称量10-30mg粉碎后的烟叶于1.5ml离心管中，加入内标溶液，用甲醇-氯仿-水萃取溶剂超声提取，超声萃取后离心，取上清液并用氮吹仪吹干；

(3)肟化反应：向吹干的提取液基质中加入甲氧胺盐酸盐溶液，斡旋震荡后在30-40℃下反应70-100min；

(4)硅烷化衍生反应：在步骤（3）之后，向离心管中加入N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺（MSTFA），斡旋震荡后在30-40℃下衍生 25-35min；

(5) 检测：采用GC-MS进行检测分析；

 色谱条件如下：

色谱柱： DB-5ms (30m×0.25mm×0.25μm)； 载气，He；流速：1.0ml/min；进样口温度：290℃；进样量：1μL；分流比为10:1；升温程序：                                                60℃保持4min，然后以5℃/min的升温速度升到310℃，保持10 min；

MS参数：采用全扫描模式；采集质量数范围：40-510。

3.根据权利要求2所述的检测新鲜烟叶中次生代谢物的衍生化GC-MS方法，其特征在于：内标溶液为用萃取溶剂配制的氘代十六烷酸溶液。

4.根据权利要求2或3所述的检测新鲜烟叶中次生代谢物的衍生化GC-MS方法，其特征在于：所述萃取溶剂甲醇-氯仿-水的配比为5∶2∶2。

5.根据权利要求2所述的检测新鲜烟叶中次生代谢物的衍生化GC-MS方法，其特征在于：所用甲氧胺盐酸盐溶液浓度为20-40mg/ml，配置在吡啶溶液中，加入量为30-70μl；反应采用水浴或摇床空气加热进行控温。

6.根据权利要求2所述的检测新鲜烟叶中次生代谢物的衍生化GC-MS方法，其特征在于：衍生化试剂三甲基硅烷基三氟乙酰胺的加入量为30-120μl，反应采用水浴或摇床进行控温。

7.根据权利要求2所述的检测新鲜烟叶中次生代谢物的衍生化GC-MS方法，其特征在于：在步骤（1）的处理过程中要迅速去处烟叶主脉，用锡箔纸包裹叶片部分，标记后放入液氮中终止烟叶生命过程，并放于-80℃低温冰箱冷冻保存，在烟叶从冰箱取出至冷冻干燥开始之前，必须用干冰包埋，进行转移。