[发明专利]一种高危人乳头瘤病毒的PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种疾病病原体基因检测技术，尤其涉及一种高危人乳头瘤病毒的PCR检测试剂盒。

背景技术

人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)的存在与多种皮肤黏膜的良、恶性增生，特别是宫颈癌的发生、发展密切相关，病毒的各型基因序列与其生物学行为存在着高度相关性。不同基因型的HPV具有不同的致病危险性。HPV DNA的检测和分型对了解相关病情、判断预后及指导治疗具有重要价值，特别是对女性生殖道肿瘤的癌情预报具有重要意义。由于缺乏体外培养系统和可靠的血清反应物，所以HPV的分类几乎完全依赖于其分子学特性。根据定义，如果L1开放阅读框中特定的291bp有10％不同就属于不同的HPV型。目前世界上发现的HPV有110余种亚型，20余种HPV亚型从宫颈癌组织中分离，根据其致病力的大小分为高危型和低危型两种，国际癌症研究协会对9个国家11次病例对照研究资料分析，将HPV6，11，40，42，43，44，54，61，70，72，81，cp6108等12种归为低危型，主要引起生殖道肛周皮肤和阴道下部的外生性湿疣类病变、扁平湿疣类病变和低度子宫颈上皮内瘤样变(CINI)，多呈一过性，可自然逆转；高危型主要为HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68，73，82等15种，主要导致CINII-III级病变和宫颈癌的发生，持续高危型HPV感染的CINI级易进展为CINII～III。

在全球范围内，每年约有20多万女性死于宫颈癌。在发展中国家，宫颈位置宫颈癌则属于常见多发的妇科肿瘤，排行榜首。我国每年新发现的病例为13.15万，死亡率最高的地区是山西，最低的是西藏。当宫颈癌的症状出现三个月后就诊者已有2/3为癌症晚期。经临床追踪观察显示，从一般的宫颈癌前病变发展为宫颈癌大约需要10年时间。从这个角度看，宫颈癌并不可怕，它是一种可预防、可治愈的疾病。防治的关键在于：定期进行妇科检查，及时发现和治疗宫颈癌前病变，终止其向宫颈癌的发展。如能落实防治措施，宫颈癌的治愈率很高。宫颈癌也是目前唯一确切知道病因的癌症，这一病因就是HPV感染。因此，检测病毒，特别是高危型病毒可预示宫颈癌的发生。

目前HPV感染的实验室诊断方法主要有两大类，第一类是检查HPV的感染间接证据，如醋酸白试验，细胞学及组织学检查等。由于这些方法检测的是HPV感染后对机体造成的异常变化，而HPV感染后对机体造成特定的异常变化需要一定的时间，因此这些方法只能检测出亚临床期和临床期，检测不出潜伏期，对临床的早期诊断意义不大。

第二类是检查组织中是否有HPV存在，如免疫组化，超薄切片电镜技术或负染技术，以PCR为基础和HPV核酸分子检测等。由于这些方法检测的是HPV感染的直接证据，在时间上可比第一类方法能更早地检测出HPV感染，更适合早期诊断。免疫组化检测标本中是否存在HPV抗原，敏感性低，特异性高，繁琐、费时，目前已逐渐被淘汰。核酸印迹杂交的灵敏度及特异性均较高，但费时，繁杂，花费大，需用新鲜标本，实验室条件要求高，目前还未普遍用于临床。超薄切片电镜技术及负染技术可在电镜下看到典型的乳头瘤病毒颗粒，但受实验条件限制，一般的实验室很少采用。以PCR为基础和HPV核酸分子检测成为目前HPV检测的主流方法。

(1)测序分析法(Sequence-based test，SBT)：该方法优点是获取序列信息最多，可以明确被测区域的多态性，并能发现新基因，是其他所有方法的参考标准。但测序法对混合感染也不易确定，特别是对于混合感染病毒比例在25％以下时，容易造成漏检，而且测序法操作繁琐，耗时费力，仪器费用高昂，难以在临床上推广使用。

(2)限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)：是较早出现的HPV基因分型检测方法，利用PCR扩增具有不同酶切位点的各种HPV基因型，将PCR产物用3-5种不同限制性内切酶进行酶切，电泳结果与已知限制性片段数据库进行比较，从而确定基因型。但该方法操作流程相对比较复杂，检测型别有限。