[发明专利]人干细胞生长因子及其聚乙二醇修饰化产物的生产方法及用途

说明书

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及人干细胞生长因子的高效表达与纯化方法，以及聚乙二醇修饰化人干细胞生长因子的制备方法及其用途。 

背景技术

干细胞生长因子(SCF)是由骨髓微环境中的基质细胞产生的一种酸性糖蛋白，它是一种重要的造血细胞因子，主要作用于早期的造血干细胞和原始造血祖细胞，促进其增殖和分化，在维持造血细胞存活，促进造血细胞增殖和分化，调控各系造血细胞的生长发育中起着重要作用。人SCF基因定位在人染色体12q22～12q24上，长1.4kb，含有7个内含子和8个外显子。天然人干细胞因子具有两种存在形式：全长分子hSCF-α(成熟mRNA完全开放读码框972bp，编码323个氨基酸，表达蛋白大小约为45KDa)和在C端保守的Ca²⁺依赖糖识别结构域(calcium dependent carbohydrate recognition domain，CRD)内缺失78氨基酸的截短型分子hSCF-β(成熟mRNA长738bp，编码245个氨基酸，表达蛋白的大小约为29KDa)。它们为同一编码mRNA在不同位点剪切所致的不同产物。 

随着研究的深入，人们发现人干细胞生长因子具有多种生物学功能，可广泛应用于生物医药、精细化工等诸多领域。特别是近年来干细胞迅猛发展，利用干细胞技术进行疾病治疗具有很大的发展前景，尤其是对于血液病的治疗具有极大的意义。骨髓移植和造血干细胞移植已经成为现代医学中治疗血液病的一种主要手段，但是还存在着血液配型困难、干细胞数量少，扩增困难等诸多问题。如果能从患者或与其配型相同的人的其他组织和器官中分离出成体干细胞，在体外实现造血细胞的定向分化，快速扩增，这将对与造血干细胞移植具有重大的意义。但天然的可溶型SCF在人体和动物体内含量甚微，在血液中的浓度为3.3ng/ml，故不可能从天然组织中分离纯化足够量样品，进行实验室和临床应用研究。在大肠杆菌中表达的重组干细胞生长因子，常形成不可溶、无生物活性的包涵体，即使复性在体内也没有活性或活性降低，且融合表达常出现氨基酸缺失、纯化方法复杂等缺点。 

SUMO融合蛋白表达系统是近年发展的一种新型蛋白表达系统，与其它蛋白表达系统相比，具有以下几点优势：1)SUMO(small ubiquitin-related modifier，小泛素相关修饰因子)不仅可以提高蛋白质在宿主菌中的表达量，而且能够大大增加蛋白的可溶性；2)准确无误地切除融合标签。由于融合标签会影响重组蛋白的结构和功能，所以融合蛋白必须切除 融合标签，通常采用化学或酶学方法，如Xa因子、凝血酶等。然而酶切融合蛋白有很多问题，产率低、蛋白沉淀、酶切条件复杂、蛋白酶昂贵等，此外还经常产生非预期的N-端。和其他蛋白酶不同，SUMO酶识别SUMO标签的三级结构，因而能准确地切除，不会产生延伸的N-端，而且酶切条件(pH、温度和离子强度)很宽松。但SUMO表达系统是否能用于SCF的表达尚未见报道。 

聚乙二醇(PEG)修饰，或称PEG化(PEGylation)，是二十世纪70年代后期逐渐发展起来的一项热门技术，是目前对蛋白质进行化学修饰最重要的技术之一，是用来解决或缓解蛋白和多肽在药用过程中存在的诸多问题的有效途径。用PEG修饰蛋白质和多肽药物可大大增加蛋白质和多肽药物的抗蛋白水解酶的降解作用。对蛋白质类药物，由于PEG修饰后，其在体内的循环半衰期显著增长，PEG修饰后，蛋白质药物在体内的药效是增大的。但是，与PEG偶合后的蛋白质和多肽，其空间构象，空间位阻，静电结合性，疏水性等理化性质都会发生变化，与受体连接的亲和力经常因这些理化性质的变化而降低，从而导致聚乙二醇修饰后蛋白质和多肽药物的体外药效降低。 

由此可见，蛋白质药物在生物体内易被蛋白酶降解，而经过PEG修饰化的蛋白质药物可以延长其半衰期，但其体外药效一般会降低。因此，如何同时提高SCF蛋白的促红细胞增殖活性和延长半衰期，需要系统的研究。 

发明内容

本发明的一个目的是提供一种人干细胞生长因子的生产方法。 

本发明的另一个目的是提供一种聚乙二醇修饰化人干细胞生长因子的制备方法。 

本发明所采用的技术方案是： 

1、一种融合基因，其编码SUMO-rhSCF-α融合蛋白。

优选的，所述的融合基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。 

2、含有上述融合基因的表达载体。 

3、人干细胞生长因子的生产方法，包括如下步骤： 

1)将2的表达载体转入宿主菌中，诱导表达SUMO-rhSCF-a融合蛋白；