[发明专利]一种免疫层析试纸及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种医学临床即时检验试纸，特别是一种免疫层析试纸及其制备方法。 

背景技术

各种基于免疫反应原理的POCT测试装置，在临床检验中具有广泛的应用。免疫金标法（Immunochromatography Assay）是九十年代初发展起来的，因其快速、操作简便、试剂稳定、可室温储运、不易污染的特点得到广泛的应用。免疫金标法是免疫亲和技术、印记技术、免疫标记技术和层析技术的组合。利用该方法将包被抗体、胶体金标记抗体固相化，与样本吸附材料等组合在一起，可制备出免疫层析诊断试纸，使用时只需要把该试纸条插入样品溶液，数分钟就可以通过肉眼观察到结果。胶体金技术开发的快速检测产品由于直接采用单克隆抗体或多克隆抗体包被硝酸纤维素膜，存在灵敏度低，特异性不够高的问题。目前，已有专利通过新工艺来提高灵敏度，如公开号为CN102103145A的中国专利公开了双放大系统来提高灵敏度；公开号为CN102192983A的中国专利公开了一种利用时间分辨荧光作为标记物来增强灵敏度和抗干扰能力，但是荧光材料存在淬灭现象，从而应用范围在很大程度上受到了限制。 

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种高灵敏度和特异性的免疫层析试纸及其制备方法。 

为解决上述技术问题，本发明的目的可采用以下技术方案予以实现： 

一种免疫层析试纸，包括塑料底衬、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫、吸水垫，硝酸纤维素膜位于塑料底衬中间，金标垫与吸水垫分别位于硝酸纤维素膜的两端，样品垫位于金标垫上；硝酸纤维素膜上包被了针对待测抗原单抗的F(ab)₂片段抗体。

所述硝酸纤维素膜包被了针对待测抗原的单克隆抗体；较优的，该单克隆抗体为待测抗原单克隆抗体经胃蛋白酶酶切与SPA-SepharoseCL-4Bcengxi柱层析的F(ab)₂片段。 

所述的硝酸纤维素膜上F(ab)₂片段的包被适合所有的临床即时检验试纸用的抗体。 

上述的免疫层析试纸的制备方法，包括以下步骤： 

1、制备单克隆抗体：通过小鼠腹腔注射杂交瘤细胞来大量制备小鼠腹水，腹水经过滤、离心初步纯化后，采用辛酸法和亲和层析法获得单克隆抗体；

2、制备单克隆抗体的F(ab)₂片段：利用酶切和层析柱洗脱获得单克隆抗体的F(ab)₂片段；

3、制备胶体金—抗原抗体复合物：将胶体金与单克隆抗体混合，孵育，离心后完成制备；

4、组装胶体金试纸：将胶体金—抗原抗体复合物喷涂到金标垫上，喷涂单克隆抗体F(ab)₂到检测线，喷涂二抗到质控线，然后组装好试纸条。

较优的，所述单克隆抗体F(ab)₂片段的制备方法，包括如下步骤： 

1、胃蛋白酶与IgG单克隆抗体按一定比例混合，37℃水浴反应适当时间，Tris碱终止反应，调节pH至8.0；

2、4℃以0.1mol/L PBS pH8.0透析4～8h，经SPA-SepharoseCL-4B层析柱，收集洗脱片段；

3、浓缩、纯化、测定浓度后保存。

 附图说明

图1：本发明试纸组成结构图

其中，1.塑料底衬；2.硝酸纤维素膜；3.金标垫；4.样品垫；5.吸水垫

图2：本发明试纸检测模式图

其中，6.质控线；7.检测线；8.样品槽；A.层析方向。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的阐述。 

以下对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明的具体条件的实验方法，通常按照常规条件。 

实施例1单克隆抗体的制备 

1、将抗原与等量的弗氏完全佐剂充分乳化，皮下注射免疫6周龄Balb/C小鼠，每只0.1ml；二免，两周后，改用弗氏不完全佐剂，用同样的方法和剂量，进行免疫；三免，操作同二免；

2、免疫5天后眼底静脉采血测效价，效价达到1:10000以上时，腹腔注射不加佐剂的抗原0.1ml，三天后处死小鼠，取其脾脏，与骨髓瘤细胞融合，用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞；