[发明专利]一种牛膝多糖的提取与纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及中药有效成分提取方法，尤其涉及的是一种牛膝多糖(ABP)的提取与纯化方法。

背景技术

中药牛膝(Radix Achyranthis Bidentatae)是苋科植物牛膝(Achyranthes bidentata B1.)的干燥根，它具有活血、通经、补肝肾、强筋骨之功用。在祖国医学中，牛膝被用于治疗多种疑难杂症，而且现代医学临床也证实牛膝对很多疾病有确切疗效。又因其原植物牛膝分布广泛，资源丰富，很有开发价值。牛膝含有多种次生代谢产物，如齐墩果酸及其皂甙、蒽醌类化合物、黄酮类化合物、生物碱、蜕皮素等，它们都具有生理活性。牛膝还含有较高比例的可溶性多糖。牛膝多糖(Achyranthes bidentata polysaccharides，ABP)有显著的抗癌、抗放射、抗肝炎、抗衰老等功效，而且具有双向免疫调节作用。牛膝多糖又有分子量小，水溶性好，毒性低的优点，不但可以口服，还可以注射，是一种很有前景的治疗用多糖药物。提取、分离、纯化牛膝多糖就显得特别重要，总多糖含量及纯度较高的牛膝多糖可为其药理及制剂研究提供原料。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种牛膝多糖的提取与纯化方法。

本发明的技术方案如下：

牛膝多糖的提取与纯化方法，包括以下步骤：

A1牛膝多糖的粗提：

将新鲜牛膝根晒至干皱，含水份＜7％，用粉碎机粉碎并过筛；称取约60目牛膝根粉，装入多功能提取罐，加工业乙醇，加热80℃回流4h；滤除乙醇，残渣减压蒸发至干，再装入提取罐；每次加蒸馏水，在100℃下搅拌提取3次，每次时间分别为5h、4h、3h；3次提取液合并，加热至沸，在搅拌下缓缓加入1％鞣酸溶液，待反应完全，继续煮沸15min，加入三次合并的提取液重量的2％活性炭，搅拌10min，抽滤除去沉淀及活性炭，得无色澄清滤液；滤液经中空纤维透析器对蒸馏水透析至无鞣酸为止；然后真空浓缩至约为三次合并的提取液原体积的1/10；浓缩液内加入3倍重量的80％乙醇，调PH至10，得白色沉淀；沉淀用80％乙醇洗涤几次，然后依次用90％、95％和无水乙醇脱水，60℃真空干燥，得粗品ABP。

A2牛膝多糖的纯化

A21 DEAE-Sepharose fast-flow柱色谱：

ABP粗品溶于10mmol/L磷酸盐缓冲液，pH 6.8，使其浓度约为30％，每次上样量60L；DEAE-Sepharose fast-flow柱预先用上述缓冲液平衡，上样后，用同样缓冲液洗脱，流速约300ml/min，按旋光检测收集多糖组份，然后减压浓缩；

A22 Sephadex G-150柱色谱：

浓缩液上Sephadex G-150柱，用0.2mol/L NaCl洗脱，按旋光检测收集多糖组分；经中空纤维透析器对蒸馏水透析脱盐，减压浓缩，冷冻干燥，得白色冻干粉ABP。

目前有关牛膝多糖的提取、分离、纯化方法所提取牛膝多糖的含量和纯度都较低。采用本发明的方法提高了总多糖的含量及其纯度。

附图说明

图1为苯酚-硫酸法测定牛膝多糖标准曲线；

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

1试验方法

1.1牛膝多糖的粗提

将新鲜牛膝根晒至干皱(含水份＜7％)，用万能粉碎机粉碎并过筛。称取约60目牛膝根粉200kg，装入多功能提取罐，加工业乙醇400L，加热80℃回流4h。滤除乙醇(回收)，残渣减压蒸发至干，再装入提取罐。每次加蒸馏水300L，在100℃下搅拌提取3次，每次时间分别为5h、4h、3h。3次提取液合并，加热至沸，在搅拌下缓缓加入1％鞣酸溶液，待反应完全(至滴入鞣酸溶液不出现混浊时为止)，继续煮沸15min，加入2％的活性炭，搅拌10min，抽滤除去沉淀及活性炭，得无色澄清滤液。滤液经中空纤维透析器对蒸馏水透析至无鞣酸为止。然后真空浓缩至约为原体积的1/10。浓缩液内加入3倍量的80％乙醇，调PH至10，得白色沉淀；沉淀用80％乙醇洗涤几次，然后依次用90％、95％和无水乙醇脱水，60℃真空干燥，得粗品ABP约48kg。

1.2牛膝多糖的纯化

1.2.1 DEAE-Sepharose fast-flow柱色谱：