[发明专利]拮抗HMGB1 B box的单克隆抗体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种拮抗HMGB1 B box这一重要炎症介质的单克隆抗体及其应用范围。 

背景技术

高迁移率族蛋白B1（high mobility group protein B1, HMGB1）为高迁移率族蛋白（HMG）家族成员之一，因在聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 中具有高迁移能力而得名。HMGB1广泛分布于淋巴组织、脑、肝、肺、心、脾、肾等组织中，HMGB1除在肝、脑组织中主要存在于胞浆外，在大多数组织中存在于胞核。HMGB1在进化过程中其氨基酸序列高度保守，啮齿类动物与人的氨基酸序列同源性高达98%以上，小鼠与大鼠氨基酸序列同源性更是高达100%。人类HMGB1基因位于13q12染色体上，包括5个外显子和4个内含子，编码含215个氨基酸的蛋白，由三个区域组成：两个正电荷区域（A盒和B盒），和一个负电荷羧基末端（酸性末端）。A 盒(aa1～79)和B 盒(aa89～163) ，是DNA 的非特异性结合区。其中B 盒前20个氨基酸是其发挥细胞因子活性的关键位点，可以诱导巨噬细胞分泌更多的致炎细胞因子如TNF-α，或树突状细胞分泌IL-6。HMGB1在胞内具有调节基因转录、稳固胞核结构的功能。胞内HMGB1可通过活化的巨噬细胞、树突状细胞主动分泌或坏死、凋亡的细胞被动释放进入胞外。释放到胞外的HMGB1通过与其配体高度聚糖化作用终产物受体(receptor for advanced glycation end products, RAGE)和Toll样受体(Toll like receptor, TLR)结合，一方面促进前炎症因子、趋化因子以及MHCII类分子的表达，进而参与CD4⁺T细胞的发育以及免疫应答的调控；另外一方面HMGB1作为晚期重要的炎症介质，参与败血症、心血管系统疾病、肿瘤、自身免疫性疾病、缺血/再灌注损伤等疾病的致病以及组织损伤与修复，中和HMGB1能够有效地的缓解以上疾病的症状，因此，HMGB1成为炎症疾病潜在的治疗靶位。而拮抗HMGB1 B box的单克隆抗体能够有效地的中和HMGB1，抑制其发挥生物学效应。 

发明内容

HMGB1是一重要的炎症介质广泛参与许多炎症疾病的致病，其生物学活性位点位于B box区域，中和HMGB1能够有效地缓解炎症疾病，因此制备拮抗HMGB1 B box的单克隆抗体对于研究HMGB1的生物学效应、以及炎症的疾病的治疗具有重要意义。 

本发明提供了分泌抗HMGB1 B box 单克隆抗体细胞株2D4E3A2，它的保藏号是CGMCC No.5534。 

本发明所述的分泌抗HMGB1 B box 单克隆抗体细胞株2D4E3A2由原核表达的B box蛋白免疫BALB/c小鼠后分离脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合而制得。 

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步说明。 

图 1是本发明中所用免疫原HMGB1 B box蛋白的表达与纯化。M：为蛋白marker；空白：为空载体；1：转化菌的全菌液；2：洗涤流出的液体；3：洗涤最后流出的液体；4-6：为纯化后的HMGB1B box蛋白。 

图 2是免疫过程示意图。 

图 3是2D4E3A2细胞系分泌的单克隆抗体亚型示意图。1，该单克隆抗体亚型；2，亚型鉴定对照图；3，该单克隆抗体轻链类型；4，轻链类型鉴定对照图。 

图 4是2D4E3A2细胞分泌的单克隆抗体用于ELISA检测示意图。 

图 5是 LPS诱导小鼠脓毒血症模型分别在4h、12h、24h心脏采血、利用2D4E3A2细胞分泌的单克隆抗体所建立的ELISA检测血浆HMGB1。*p<0.01 。 

图 6是 利用2D4E3A2细胞分泌的单克隆抗体采用Western blot法检测巨噬细胞HMGB1表达水平。 

图 7 2D4E3A2细胞分泌的抗体能够有效地的缓解心肌炎心肌的损伤，C 代表对照组 E 代表实验组 E-B 代表2D4E3A2抗体干预组。 

本发明的细胞株2D4E3A2于2011年11月30日提交到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为分泌抗HMGB1 B box 单克隆抗体细胞株，保藏编号为CGMCC No.5534。保藏单位地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。 

具体实施方式