[发明专利]一种羊口疮病毒蛋白ORFV059单克隆抗体杂交瘤G3及单克隆抗体

说明书

 

技术领域

本发明涉及细胞工程领域，具体涉及羊口疮病毒结构蛋白ORFV059单克隆抗体杂交瘤细胞株G3及单克隆抗体。

背景技术

羊传染性脓疱病（Orf）又称羊传染性脓疱性炎，俗称羊口疮，是由口疮病毒（ORFV）引起的山羊和绵羊的一种急性、接触性传染病。其病变特征是患羊口唇等处皮肤和黏膜形成红斑、丘疹、脓疮、溃疡和疣状结痂。羔羊极易感，多群发。本病在世界各地均有发生，我国主要养羊区也较常见，是危害羊群的主要疾病之一。该病毒抵抗力强，羊群一旦被感染则不易清除，可持续危害羊群多年，给畜牧业造成重大经济损失。

ORFV病毒属痘病毒科，副痘病毒属。病毒粒子呈砖形或椭圆形，其表面呈绳索样纵横交错排列结构。该病毒可在牛、绵羊、山羊的肾细胞以及犊牛和羔羊的睾丸细胞上生长，并产生细胞病变。ORFV引发病灶的病理组织学特征包括角化细胞的空泡变化、肿胀，细胞间质玻璃样变性，表皮增生显著,  表皮内微肿胀，皮下组织中性粒细胞、树突状细胞(DCs)、T细胞和B细胞聚集。

羊口疮分布广泛，传染性强，一旦爆发会造成严重的经济损失。病毒在病变部位持续存在，患病动物易重复感染，目前无有效疫苗，防控困难。因此，羊口疮病毒的早期、准确检出对于疾病的控制和预防具有重要的意义。兽医临床上羊口疮病的诊断主要根据其典型症状进行诊断，但无法与口蹄疫（foot-and-mouth disease,FMD）和羊痘（Capripox）区分。目前所采用的实验室诊断方法分为，(1) 免疫学方法，如ELISA, Western blotting，免疫组织化学(IHC)等; (2) 病理组织学; (3)分子生物学方法，如PCR和限制性片段长度多态性（RFLP）分析等。其中以免疫学诊断方法最为重要，因其具有灵敏、快速、准确的特点，而特异性的抗体尤其是单克隆抗体是免疫学诊断中最重要的工具。近年，在我国吉林省和甘肃省的羊群中几次爆发羊口疮疫情，由于特异性抗体的缺乏，疾病控制和进一步研究工作无法有效开展。

ORFV基因组全长约138kb，G+C含量丰富（63%-64%），含132个基因。通过对羊口疮病毒不同株(系)的基因组分析表明，ORFV059基因编码的是一个免疫显性蛋白。该蛋白定位于成熟病毒粒子胞膜， 是C端锚定蛋白, 与痘苗病毒H3L免疫显性蛋白结构相似，它在病毒成熟、吸附、病毒致病的分子机制以及疾病诊断和亚单位疫苗研发等过程中具有重要作用。因此，ORFV059有作为潜在的临床诊断靶标的可能，制备ORFV059的单克隆抗体具有十分重要的意义，可以为该蛋白功能的研究奠定基础，同时为其作为疾病标志物的可行性提供实验数据支持。

由于ORFV059定位于成熟病毒粒子胞膜，通常在组织标本中表达量较高，具有临床检测和验证的价值。由此，制备能用于临床标本免疫组化检测的ORFV059单克隆抗体进行大批量组织标本的验证，可为其作为羊口疮临床诊断靶标的验证提供有力工具。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种能用于ELISA、western-blot、免疫荧光以及免疫组织化学检测的抗羊口疮病毒蛋白ORFV059单克隆抗体。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明所述的检测羊口疮病毒蛋白ORFV059的抗体是用原核重组表达的ORFV059蛋白作为抗原免疫BALB/C小鼠获得，并用细胞融合技术获得产生这种抗体的杂交瘤细胞株G3，杂交瘤细胞分泌的抗体为IgG2b阳性，轻链为κ型。所述抗羊口疮病毒蛋白ORFV059单克隆抗体杂交瘤G3，于2011年11月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.5425。

本发明中羊口疮病毒蛋白ORFV059的氨基酸序列为AAR98154，如SEQ ID NO：1所示。本发明中羊口疮病毒蛋白ORFV059的基因序列为AY386263，如SEQ ID NO：2所示。

本发明中ORFV059的全长基因是由羊口疮病毒基因组为模板, 由PCR扩增获得。扩增ORFV059基因的引物序列为：上游引物：5’-CATTAAC CATGGATCCACCCGAAATCACGGC-3’（SEQ ID NO：3），下游引物：5'- AATCATCTCGAGCACGATGGCCGTGACCAGCAGC-3’（SEQ ID NO：4）。上游引入NcoI 内切酶位点，下游引入XhoI内切酶位点。原核表达载体选择pET-28a（+）。