[发明专利]白菜AHA10基因家族及其应用

说明书

本申请是申请号为201010281925.X，申请日为2010-09-15，发明创造名称为“甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝AHA10基因家族及其应用”的分案申请。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及甘蓝型油菜(Brassica napus)及其亲本物种白菜(Brassica rapa)和甘蓝(Brassica oleracea)AHA10(autoinhibited H⁺-ATPase 10，自抑制H⁺-ATP酶10)基因家族及其应用。

背景技术

十字花科(Brassicaceae)的芸薹属(Brassica)包括很多油料作物、蔬菜和观赏植物品种，为人类提供营养价值丰富的食用油、蔬菜和观赏植物，并为畜牧业提供饲料，具有重要的经济价值。在芸薹属物种中，异源四倍体物种甘蓝型油菜是由2个二倍体物种白菜和甘蓝通过种间杂交后再加倍而形成的。甘蓝型油菜是世界第二大油料作物，在全世界广泛种植，栽培面积和产量仅次于大豆。白菜和甘蓝也是重要的油料、蔬菜和观赏作物。对甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝功能基因的比较基因组学研究将为揭示它们之间的遗传进化关系提供理论基础，并为芸薹属作物的性状改良提供应用基础。

籽粒颜色是甘蓝型油菜的重要性状之一。甘蓝型油菜黄籽品系具有种皮薄、皮壳率低、粗纤维含量低、含油量高、饼粕蛋白含量高等优点，与黑籽品系相比，饼粕的经济价值和油的品质都有所提高。虽然白菜和甘蓝中均存在表型稳定的天然黄籽基因型，但自然界中不存在天然的甘蓝型油菜黄籽基因型。已有的甘蓝型油菜黄籽材料主要通过远缘杂交等方式而创造，存在黄籽率和黄籽度不高，表型不稳定，易受环境影响而变异，选育效率低，育种周期长，负相关性状难以克服等缺点，远远不能满足生产要求。因此，获得稳定遗传的甘蓝型油菜黄籽性状成为甘蓝型油菜育种的重要目标。长期以来，全世界众多研究者对该性状进行了广泛研究，但到目前为止对于黄籽性状形成的分子机理仍不清楚，更没有通过转基因分子育种创造黄籽性状的任何报道。

芸薹属和拟南芥(Arabidopsis thaliana)同属十字花科，具有较近的亲缘关系。原花青素(proanthocyanidin，PA)是形成甘蓝型油菜黑籽颜色的基础，在黄籽种皮中明显降低。拟南芥AHA10(AtAHA10)基因参与了种皮中原花青素的聚合，也影响着早期种皮细胞中液泡的发育。在拟南芥aha10突变体中，虽然花青素(anthocyanidin)能在种皮中正常的积累，但原花青素的积累量只有非突变体的百分之一，这表明质膜H⁺-ATPase参与了原花青素在种皮细胞中的代谢，特别是在原花青素的聚合过程中起着重要的调控作用。AtAHA10基因的突变同样使得突变体种子的种皮呈现出透明种皮的特性。在正常的拟南芥种子发育早期，种皮内层细胞中能观察到较大的液泡，而在拟南芥aha10突变体中只能看到一些较小的液泡，但随着种皮的逐渐成熟，这些差别会随之消失，表明该基因的突变导致了液泡发育的延迟。因此，在芸薹属中对AHA10基因进行同源克隆和功能鉴定，将有助于揭示甘蓝型油菜种皮色素和早期种皮细胞中液泡发育的分子机理，是筛选甘蓝型油菜黄籽位点的重要途径。

芸薹属和拟南芥起源于同一祖先，约在1700～1800万年前发生分离，芸薹族植物发生了基因组水平的三倍化，即芸薹属基本种：白菜(AA组，529Mbp)、甘蓝(CC组，696Mbp)和黑芥(BB组，632Mbp)等的基因组约相当于拟南芥基因组(157Mbp)的3倍，而甘蓝型油菜(AACC组，1132Mbp)的基因组相当于甘蓝和白菜两个基因组之和，约相当于拟南芥基因组的6倍，也就是说，在拟南芥中为单拷贝的基因在甘蓝和白菜中可能分别有3个对应的拷贝，而在甘蓝型油菜中可能有6个拷贝。目前，除AtAHA10基因外，尚无其它植物的AHA10基因被克隆，对AHA10基因的研究报道较少，而AHA10基因在甘蓝型油菜、白菜、甘蓝等芸薹属物种中的成员数、蛋白特征、进化关系、表达的组织特异性及与黄籽性状的关系、转基因分子育种等都未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝AHA10基因家族。

为达到上述目的，本发明采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术，分别克隆了甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝AHA10基因家族成员的全长cDNA和对应的基因组序列，并进行了系统分析。结果显示：