[发明专利]从表达腺病毒E1A蛋白的细胞中获得唾液酸化增加的重组蛋白质的方法及由此获得的蛋白质

说明书

本申请是申请日为2005年12月18日的申请号为200580045170.0标题为“从表达腺病毒E1A蛋白的细胞中获得唾液酸化增加的重组蛋白质的方法及由此获得的蛋白质”的申请的分案申请

发明领域

本发明涉及重组蛋白质生产领域，特别涉及重组蛋白质如红细胞生成素的糖基化，更特别涉及当在表达腺病毒E1A的细胞中生产时重组蛋白质的糖基化。

发明背景

如WO 00/63403所示，表达至少腺病毒E1A蛋白的永生化人胚胎视网膜细胞可适用于生产重组蛋白质。

在表达腺病毒E1A的细胞中产生的具有N联糖基化的重组蛋白质具有特异性糖基化模式，例如特征在于存在Lewis-X结构，如WO03/038100所述。

在表达E1A的细胞中产生的蛋白质的另一特征是呈现相对低的半乳糖基化及低唾液酸化的N联聚糖(WO 03/038100)。对于某些目的，这可能是有益的，但对于其它目的，较高水平的半乳糖基化及优选同时唾液酸化是有益的。

例如，在表达E1A的细胞中产生的红细胞生成素(EPO)具有显著量的Lewis-X结构和在N联聚糖中相对低百分比的半乳糖基化和唾液酸化(WO 03/038100)，产生非常适于治疗缺血/再灌注损伤但不太适合治疗贫血的分子。对于治疗贫血，已经确定EPO的高度唾液酸化有益于增加治疗对象血清中EPO的半衰期，由此延长该物质处于活性的时间而增加红细胞计数(Goldwasser et al.，1974)。

因此，对于治疗缺血/再灌注损伤，在表达E1A的细胞中表达EPO对于为此用途产生的EPO的优选糖基化模式具有潜在益处。然而，对于EPO的其它应用，不同的糖基化模式可能是有益的。

对于其它蛋白质可存在类似情况，即对于某些应用，基于在表达E1A的细胞中表达而观察到的特定糖基化模式可能是高度有益的，而对于其它目的，不同的糖基化模式也许更适合。

已经对于其它细胞类型描述了在细胞中过表达唾液酸转移酶以增加在该细胞中产生的重组蛋白质的唾液酸化(例如Grabenhorst et al.，1995；Minch et al，1995；Jenkins et al，1998；Zhang et al，1998；Weikert et al，1999；Fukuta et al.，2000；Prati et al.，2000)。然而考虑到糖基化的复杂性及仍未清楚E1A在其中的作用(WO 03/038100)，从前还未知这种方案是否在表达E1A的细胞中产生所期望的结果。特别地，在表达E1A的细胞中糖基化过程中不同糖基化转移酶与其它参与者之间的相互影响和潜在竞争使得尚无法预料及不可预知唾液酸转移酶在这种细胞中的过表达对因此产生的蛋白质糖基化模式方面的结果。

为了拓宽在表达E1A的细胞中产生的重组蛋白质的潜在应用范围，增加这种蛋白质的半乳糖基化和唾液酸化是有益的。本发明的一个目的是提供实现这个目的的方法。本发明进一步涉及提供得自表达E1A的细胞的新的红细胞生成素组合物。

本发明的另一目的是提供降低在细胞例如表达腺病毒E1A的细胞中重组表达的蛋白质上LacdiNAc结构的平均含量的方法。

附图简述

图1.通过对商购EPO(EPREX^TM，泳道A)、在PER.C6-EPO-ST克隆25-3.10中产生的EPO(泳道B)及在PER.C6-EPO克隆25中产生的EPO(泳道C)进行等电聚焦确定的唾液酸含量。图中也示出了每个EPO分子推定的唾液酸数目。

图2.在DMEM中，贴壁细胞培养物(A)及在无血清培养基中悬浮细胞培养物(B)中产生的PER.C6-EPO的去唾液酸化N联糖的MALDI-MS谱。

图3.对在VPRO培养基中无血清悬浮培养物中不过表达唾液酸转移酶的PER.C6细胞中产生的EPO(泳道1)、在VPRO中无血清悬浮培养物中过表达α-2，6-唾液酸转移酶的PER.C6细胞(即PER.C6-EPO-ST克隆25-3.10)中产生的EPO(泳道2)及商购的EPO即EPREX^TM(泳道3)通过等电聚焦确定的唾液酸含量。