[发明专利]一种提高微生物有机溶剂耐受性的基因及其编码蛋白质与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高微生物有机溶剂耐受性的基因及其编码的蛋白质，属于生物工程技术领域。应用于通过基因工程手段提高恶臭假单胞菌和大肠杆菌等革兰氏阴性菌的有机溶剂耐受能力。

背景技术

大多数的有机溶剂对微生物都是有毒害作用的，有机溶剂能够破坏细胞膜表面的磷脂双分子层，使细胞失去结构和功能上的完整性，从而导致微生物细胞裂解死亡。1989年，Aono和Inoue研究表明，有机溶剂对细胞的毒性大小可以用溶剂在辛醇和水中的分配系数（Log P_ow）来表示，Log P_ow的值越低，表示该溶剂的疏水性越高，对微生物的毒害作用越大。然而在全细胞生物催化反应中，为了降低产物的抑制作用和实现生物转化与分离的耦合，提高转化效率，常需要采用水/有机相两相体系。虽然微生物自身具有一定的溶剂耐受性，但绝大多数微生物对有机溶剂的耐受性较低，甚至0.1%（v/v）的有机溶剂就可以导致细胞的裂解死亡，因此探究微生物的耐溶剂性机制，提高微生物细胞对有机溶剂的耐受性就显得尤为重要。

1989年，Inoue等在Nature上首次报道了筛选获得的Pseudomonas putida能够耐受50%（v/v）甲苯和高浓度的环己烷、二甲苯等。1991年，Aono和Inoue的研究小组报道了通过溶剂平板筛选和NTG诱变成功获得了大肠杆菌耐溶剂突变株OST系列菌株。该小组对大肠杆菌OST菌株的研究显示，对于细胞膜疏水性有明显影响的一些细胞膜组分的表达水平是影响大肠杆菌细胞溶剂耐受性的重要原因。细胞外膜上的脂多糖LPS（lipopolysaccharide）成分的增加导致了细胞外膜疏水性的降低，从而使细胞溶剂耐受性增加。在对具有溶剂耐受性重组菌株与其野生型亲本菌株的生长对比时发现，细胞外膜蛋白和应激反应蛋白与微生物细胞的耐溶剂性紧密相关。基因芯片技术（DNA microarray）的应用也使得更多的耐溶剂性相关基因被发现，Shimizu 等发现glpC基因编码的一种膜蛋白（厌氧型甘油-3-磷酸脱氢酶C亚基），能显著提高菌株的耐溶剂性，其原因可能是细胞外膜结构的改变导致其疏水性的降低。另外，甘露糖的磷酸转移酶系统ManXYZ在大肠杆菌中的表达可以改变细胞膜表面的性质，使其对糖类的亲和性提高，从而对溶剂（正己烷）的耐受性有显著提高。但是，微生物的耐溶剂性机制目前尚无明确完善的体系。

早在1970年，Bannerjee等人阐明了3-羟基异丁酸脱氢酶是NAD⁺依赖型的氧化还原酶，参与缬氨酸的代谢途径。但是目前并无报道涉及3-羟基异丁酸脱氢酶在提高恶臭假单胞菌和大肠杆菌等革兰氏阴性菌的有机溶剂耐受性方面的作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高微生物耐有机溶剂性的方法。mmsB基因在恶臭假单胞菌中表达水平的提高与其有机溶剂耐受性的提高相关；同时，mmsB基因在大肠杆菌宿主中的重组表达能显著提高大肠杆菌细胞等革兰氏阴性菌的有机溶剂耐受性。从而为阐明微生物细胞溶剂耐受性提供了有效方法，并为构建适用于工业化应用的溶剂耐受性整体细胞生物催化剂提供了理论依据。

本发明的技术方案：由微生物菌株恶臭假单胞菌P. putida通过驯化培养获得耐有机溶剂突变菌株（Pseudomonas putida）JUCT1，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2011442。

提取该驯化菌株CCTCC NO：M 2011442的总蛋白，通过二维电泳技术，比对分析P. putida CCTCC NO：M 2011442在不同溶剂条件下蛋白组的表达差异，经扫描后，使用PDQuest^TM 2-D Analysis Software（Bio-Rad公司）分析比对蛋白质点，采用基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱（MALDI-TOF/TOF）鉴定不同溶剂条件下表达量差异大的蛋白，并将质谱结果与NCBI数据库中的已知蛋白序列进行比对，最终确定该CCTCC NO：M 2011442的蛋白质为3-羟基异丁酸脱氢酶，由mmsB基因编码。

采用引物：

上游引物：5'-ATCGGGATCCATGCGTATTGCATTCATTGG-3'（BamH Ⅰ）