[发明专利]根据蛋白质-DNA复合物晶体结构设计新型TALE的方法

说明书

本发明涉及根据蛋白质‑DNA复合物晶体结构设计新型TALE的方法。本发明提供了设计特异识别DNA的TALE蛋白的方法。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地说，涉及根据蛋白质-DNA复合物晶体结构设计新型TALE的方法。

背景技术

TALEs(Transcription Activator Like Effectors，转录激活子样效应因子)是植物致病菌(Xanthomonas)细胞内的一种蛋白质。当病原菌侵染植株时，病菌会通过其自身的III型分泌系统将包括TALE在内的一系列效应分子注入到植物细胞内。这些效应分子通过影响宿主细胞的信号传递，基因表达等方式来协助病菌进一步扩增。TALE则是这些效应分子中最大的一类，它像植物基因的转录激活子一样行使功能。

TALE家族蛋白一般由3个主要的功能结构域组成，N端结构域与TALE的分泌转运有关；C端具有转录激活结构域和入核信号肽片段；位于TALE中部的区域是DNA结合结构域，但它的DNA结合结构域不同于其他已知的DNA结合结构域，它是由一段串联的重复单元组成，大多数情况下每个重复单元由34个氨基酸组成，个别重复单元由33或35个氨基酸残基组成。这34个氨基酸中除了第12，13位的氨基酸变化较大之外，其他氨基酸高度保守。这两个不保守的氨基酸被命名为RVD(repeat variable diresidue，重复可变双残基)。2009年的两篇文章分别通过实验和生物信息学研究发现每个重复序列中12，13位的氨基酸和识别的核苷酸种类有特殊的对应关系，比如：

TALE蛋白的特异DNA序列识别以及灵活的可组装性为它们在分子生物学中的应用提供了巨大的前景，科学家们可以设计组装任意的TALE单元去识别任意的DNA双螺旋序列。这一特性已经被用来构造切割特异双链DNA序列的DNA酶TALEN(TALE nuclease，TALE核酸酶)，用于在细胞基因组中引入定点突变、定点敲除等操作。在目前所有已知的报道中，TALE识别的都是双链的DNA螺旋(dsDNA)。然而在没有结构结构信息之前，并不知道如何组装、改造TALE蛋白；

发明内容

发明人在世界上首次解析了一个经过改造的TALE蛋白dHax3在没有DNA(图8)和结合DNA(图9)情况下的两个高分辨率晶体结构。

发明人成功解析了一个经过改造的TALE蛋白dHax3DNA结合域与dsDNA的晶体结构。通过对该结构的分析和对比除了不仅揭示出TALEdHax3蛋白每一个组装单元特异识别每一个DNA碱基的分子基础，还显示双链DNA里只有一条编码链与TALE相互作用。

发明人通过生物化学实验发现TALE蛋白可以特异识别甲基化的DNA，并成功解析了dHax3蛋白与包含了5-甲基胞嘧啶的DNA双链(5mC-dsDNA)复合体的晶体结构。

本发明提供了一种设计新型TALE蛋白组装单元的方法，包括以下步骤：

1)位于组装单元第16、17位的残基采用侧链含有氢键供体基团或碱性的氨基酸，例如Arg，Lys，His，Asn，Gln；

2)位于组装单元第12位的残基采用侧链含有氢键供体基团，例如His，Asn，Gln，Ser，Thr，Tyr，Lys，Arg；

3)对于碱基腺嘌呤A，组装单元第13位的残基选自Asn，Asp，Gln，Glu，Ser，Thr；

4)对于碱基鸟嘌呤G，组装单元第13位的残基选自Asn，Gln，Asp，Glu，His，Lys，Arg，Ser，Thr；