[发明专利]一种烟草黑胫病病菌液固复合体系培养方法及培养物应用

权利要求书

1.一种烟草黑胫病病菌的液固复合体系培养方法，包括病菌分离、平板培养、液体培养、固体培养，其特征在于培养方法具体包括以下步骤：

A、病菌分离，从发病田块中采集病株，经过分离、纯化、致病力测定，获得病菌，将菌种采用菌丝块水浸法置于10℃条件下恒温保存，备用；

B、平板培养，将病菌接种于培养基平板上，于24~30℃温度下培养5~7天，选择菌丝纯白色，在平板表面密布一层菌丝的培养物，用作液体培养菌种； 

C、液体培养，将B步骤得到的平板菌丝接种于培养液中，于24~30℃温度下，130~150r/min转速下振荡培养5~7天，培养得到的液体菌液中菌丝白色、菌液不浑浊、菌丝不成团，镜检可发现游动孢子囊和游动孢子或休止孢，每毫升孢子含量在1万个以上；

D、固体培养，将C步骤得到的液体菌丝接种于固体培养基，24~30℃培养8~12天，培养得到的固体培养物整个基质布满白色菌丝，菌丝经过液体浸泡、低温诱导、室温释放孢子，镜检可见游动孢子囊和游动孢子或休止孢，每毫升孢子含量在10万个以上。

2.根据权利要求1所述的液固复合体系培养方法，其特征是：所述的B步骤中的培养基为燕麦、芝麻、黑麦、白芸豆、利马豆、大豆培养基中的任意一种。

3.根据权利要求1或2所述的液固复合体系培养方法，其特征在于：所述的C步骤中的培养液为20~30g的燕麦、芝麻、黑麦、白芸豆、利马豆、大豆中任意一种，加入1000mL蒸馏水中浸泡18~28小时后，将组织捣碎后过滤，常规湿热方法灭菌，再加入用10~20g 6~7叶期感病烟苗鲜根按上述方式捣碎、过滤灭菌制备的烟根组织液混匀即得到培养液，所述培养液占容器容积的30%~50%。

4.根据权利要求1或2所述的液固复合体系培养方法，其特征是：所述的C步骤中的培养液为150~250g新鲜胡萝卜、番茄、大豆芽、绿豆芽中的任意一种，加入1000mL馏水，将组织捣碎后过滤，再依次经过0.45μm、0.22μm滤膜过滤后灭菌；再加入用10~20g 6~7叶期感病烟苗鲜根按上述方式捣碎、过滤灭菌制备的烟根组织液混匀即成，所述培养液占容器容积的30%~50%。

5.根据权利要求1所述的液固复合体系培养方法，其特征是：所述的C步骤平板菌丝接种于培养液是用灭菌的解剖刀切取烟草黑胫病病菌菌丝块，菌丝块大小为2~4×2~4mm，固体培养基载体厚度为1~2mm，每100毫升培养液接种菌丝2~4块。

6.根据权利要求1所述的液固复合体系培养方法，其特征是：所述的D步骤固体培养基为粒径1~3mm的粗米糠或豌豆杆粉或蚕豆杆粉中的一种或一种以上，与粗麦麸以3~4:1~2的质量比混匀，加入 40%~50%的水充分混匀，固体培养基占容器容积的50%~80%，常规湿热灭菌。

7.根据权利要求1或6所述的液固复合体系培养方法，其特征是：所述的D步骤固体培养基为粒径1~3mm的新鲜豆腐渣和粗麦麸以6~8:1~2的质量比混匀，加水混合控制含水量为40%~50%，固体培养基占容器容积的50%~80%，常规湿热灭菌。

8.根据权利要求1所述的液固复合体系培养方法，其特征是：所述的D步骤液体菌丝接种于固体培养基系按3%~5%的体积比加入，加入后培养基底部无积液。

9.权利要求1或8所述的液固复合体系培养方法获得的培养物用于烟草黑胫病的人工接种物，或者用于制备带烟草黑胫病病菌病土的添加物。