[发明专利]一种谷氨酸转运蛋白-1基因的cRNA 原位杂交探针及其制备方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物医学领域，涉及一种探针及其制备方法，尤其是谷氨酸转运蛋白-1基因的cRNA原位杂交探针及其制备方法。 

背景技术：

谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统最重要的神经递质，在体内主要与亲离子性和亲代谢性两种谷氨酸受体家族结合发挥活化作用。谷氨酸如果在细胞外浓度过高，过度兴奋谷氨酸受体可导致神经细胞死亡，由于细胞外没有能分解谷氨酸的酶，释放的谷氨酸几乎完全依赖神经元以及神经胶质细胞膜上的谷氨酸转运蛋白(EAAT)的摄取来保持浓度的相对稳定，同时EAAT也为体内很多代谢途径提供谷氨酸来源。谷氨酸转运蛋白分高亲合力和低亲合力转运蛋白两种，高亲合力转运蛋白都作用于依赖钠-钾的L-谷氨酸，L-和D-天冬氨酸，所以也称为钠-钾谷氨酸转运蛋白或兴奋性氨基酸转运蛋白(Excitatory amino acid transporter，KAAT)；目前已有五种被克隆，它们是它们是谷氨酸转运蛋白-1(EAAT1或GLAST，Glutamate-aspartate transporter)，谷氨酸转运蛋白-2(EAAT2或GLT，glial glutamate transporter)，谷氨酸转运蛋白-3(EAAT3EAAC，excitatory amino acid Carrier)，谷氨酸转运蛋白-4(EAAT4)和谷氨酸转运蛋白-5(EAAT5)。在形态学研究方面，关于谷氨酸转运蛋白-1基因在活体动物中mRNA水平的检测显示尚属空白。 

发明内容：

本发明的目的在于提供一种谷氨酸转运蛋白-1基因cRNA原位 杂交的探针及其制备方法。 

本发明的目的是通过以下技术方案来解决的： 

一种谷氨酸转运蛋白-1基因的cRNA原位杂交的探针，该探针的序列为： 

5′TCCTGCCTCTCCTCTACTTCCTGGTAACCCGGAAGAACCCCTGGGTTTTCATTGGAGGGTTGCTGCAAGCACTCATCACAGCCCTGGGGACCTCCTCAAGTTCTGCCACCCTGCCCATCACTTTCAAGTGCCTGGAAGAAAACAATGGTGTGGACAAACGCATCACCAGATTTGTGCTTCCCGTGGGGGCCACCATTAACATGGATGGGACCGCCCTCTACGAGGCTTTGGCCGCCATTTTCATCGCTCAAGTTAACAACTTTGACCTGAATTTTGGACA 3′。 

所述探针的制备方法： 

(1)根据谷氨酸转运蛋白-1的Gene bank序列我们设计了谷氨酸转运蛋白-1特异的引物，并且此对引物扩增出280bp的谷氨酸转运蛋白-1片段作为谷氨酸转运蛋白-1特异的探针序列； 

(2)构建谷氨酸转运蛋白-1的cRNA原位杂交的探针质粒；将探针质粒转化细菌后，细菌培养后进行测序； 

(3)制备谷氨酸转运蛋白-1的cRNA原位杂交探针； 

(4)检测谷氨酸转运蛋白-1的cRNA探针的原位杂交。 

所述步骤(1)中谷氨酸转运蛋白-1特异的引物是： 

上游引物是5′TCCTGCCTCTCCTCTACTTC 3′； 

下游引物是5′GTCCAAAATTCAGGTCAAAG 3′。 

述步骤(2)按照如下步骤进行： 

(a)将大鼠的cDNA用设计的引物进行PCR扩增； 

(b)将PCR产物用TIANGEN胶回收试剂盒进行胶回收； 

(c)将回收后的产物于4℃与多克隆位点两端具有T7，SP6启动子的载体进行连接； 

(d)将连接好的质粒转化细菌后，细菌培养后进行测序。 

所述步骤(3)按照如下步骤进行： 

(a)步骤(2)得到的细菌测序正确后，经判断确认谷氨酸转运蛋白-1探针序列插入载体的顺序是反向的； 

(b)需要使用Xba I限制性内切酶对质粒进行酶切； 

(c)将酶切产物用TIANGEN胶回收试剂盒进行胶回收； 

(d)用T7RNA聚合酶对探针进行体外转录标记。 

所述步骤(4)按照如下步骤进行：