[发明专利]一种谷氨酸转运蛋白-3基因的cRNA 原位杂交探针及其制备方法无效

专利信息
申请号: 201210022007.4 申请日: 2012-02-01
公开(公告)号: CN102559904A 公开(公告)日: 2012-07-11
发明(设计)人: 魏燕燕;黄静;陈晶;王亚云;李云庆;武胜昔 申请(专利权)人: 中国人民解放军第四军医大学
主分类号: C12Q1/68 分类号: C12Q1/68;C12N15/11;C12N15/10
代理公司: 西安通大专利代理有限责任公司 61200 代理人: 陆万寿
地址: 710032 *** 国省代码: 陕西;61
权利要求书: 查看更多 说明书: 查看更多
摘要:
搜索关键词: 一种 谷氨酸 转运 蛋白 基因 crna 原位杂交 探针 及其 制备 方法
【权利要求书】:

1.一种谷氨酸转运蛋白-3基因cRNA原位杂交的探针,其特征在于,该探针的序列为:

5′GCTGTGCGGAAGAAAAGAACCACGTGGACAAGAGGATCACAAGATTTGTGCTGCCCGTCGGCGCCACCATCAACATGGACGGCACTGCGCTCTATGAAGCCGTGGCAGCTGTGTTCATTGCGCAGCTGAACGGCATGGACCTGAGCATTGGGCAGATCATCACGATCAGCATCACAGCCACCGCTGCTAGCATTGGAGCTGCCGGTGTGCCCCAGGCTGGCCTGGTGACCATGGTGATCGTGTTGAGTGCCGTGGGGCTGCCTGCTGAGGACGTCACCCTCATCATTGCCGT 3′。

2.如权利要求1所述探针的制备方法,其特征在于:

(1)根据谷氨酸转运蛋白-3的Gene bank序列我们设计了谷氨酸转运蛋白-3特异的引物,并且此对引物扩增出292bp的谷氨酸转运蛋白-3片段作为谷氨酸转运蛋白-3特异的探针序列;

(2)构建谷氨酸转运蛋白-3的cRNA原位杂交的探针质粒;将探针质粒转化细菌后,细菌培养后进行测序;

(3)制备谷氨酸转运蛋白-3的cRNA原位杂交探针;

(4)检测谷氨酸转运蛋白-3的cRNA探针的原位杂交。

3.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中谷氨酸转运蛋白-3特异的引物是:

上游引物是5′GCTGTGCGGAAGAAAAGAAC 3′;

下游引物是5′ACGGCAATGATGAGGGTGAC 3′。

4.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)按照如下步骤进行:

(a)将大鼠的cDNA用设计的引物进行PCR扩增;

(b)将PCR产物用TIANGEN胶回收试剂盒进行胶回收;

(c)将回收后的产物于4℃与多克隆位点两端具有T7,SP6启动子的载体进行连接;

(d)将连接好的质粒转化细菌后,细菌培养后进行测序。

5.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(3)按照如下步骤进行:

(a)步骤(2)的到的细菌测序正确后,经判断确认谷氨酸转运蛋白-3探针序列插入载体的顺序是正向的;

(b)需要使用BamH I限制性内切酶对质粒进行酶切;

(c)将酶切产物用TIANGEN胶回收试剂盒进行胶回收;

(d)用SP6RNA聚合酶对探针进行体外转录标记。

6.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(4)按照如下步骤进行:

(a)将大鼠用0.4%戊巴比妥钠深麻后,经左心室插管至升主动脉,用0.01mol/L的DEPC-PBS的快速冲洗去除血液,再以4%多聚甲醛灌注固定;所述的0.01mol/L DEPC-PBS是2.9克磷酸氢二钠,0.29克磷酸二氢钠,9.0克氯化钠用超纯水定容至1L后,再加入体积百分比为0.1%的DEPC 1ml放置过夜后,高压灭菌制成的磷酸盐缓冲液;所述4%的多聚甲醛是40.0克多聚甲醛加入500.0ml蒸馏水加热使之解聚溶解后,再加入500.0ml的0.2mol/L PB缓冲液定容至1000ml;所述0.2mol/L PB缓冲液是用29.01克磷酸氢二钠,2.96克磷酸二氢钠加超纯水定容至500ml配制而成;

(b)取材后进行脑组织的后固定:于4℃,用4%的多聚甲醛后固定24小时;

(c)将固定好的组织进行切片:将组织切成25~30μm组织切片,并将切好的切片保存于0.01mol/L的DEPC-PBS中,放于4℃冰箱备用;

(d)将切好的组织片用0.01mol/L的DEPC-PBS清洗1次,室温,每次5-10分钟;

(e)将上述清洗过的片子用5 x SSC清洗2次,室温,每次5-10分钟;所述5 x SSC是由20 x SSC用超纯水稀释的,20 x SSC为一种柠檬酸缓冲液;

(f)将5 x SSC清洗后的组织片浸入预杂交液中,于55℃,在杂交炉孵育1-2小时;所述预杂交液是由5ml的去离子甲酰胺,2.5ml的20 x SSC溶液,200μl的50 x Denhardt’s溶液,50μl的浓度为200mg/ml的Heparin溶液,100μl的浓度为10mg/ml的tRNA溶液,100μl的浓度为10%的CHAPS溶液,100μl的浓度为10%的Tween-20溶液,100μl的浓度为0.5mol/L的pH8.0的EDTA溶液和1.85ml的DEPC-H2O混合配制而成;所述50 x Denhardt’s为一种常用的杂交试剂;所述200mg/ml的Heparin为200mg的Heparin粉末溶于1ml的DEPC-H2O中配制而成;所述10mg/ml的tRNA为10mg的tRNA粉末溶于1ml的DEPC-H2O中配制而成;所述10%的CHAPS为1g的CHAPS溶于1ml的DEPC-H2O中配制而成;所述10%的Tween-20为100μl的Tween-20溶于900μl的DEPC-H2O中配制而成;所述0.5mol/L的pH8.0的EDTA为186.1g二水乙二胺四乙酸二钠加入800ml的DEPC-H2O中在磁力搅拌器上剧烈搅拌,用NaOH调pH值至8.0然后定容至1L配制而成高压灭菌备用;所述DEPC-H2O为1L超纯水加入体积百分比为0.1%的DEPC 1ml,放置过夜并高压灭菌处理后的水;

(g)将预杂交孵育后的组织切片浸入杂交液中,于55℃,在杂交炉中孵育16-20小时;所述杂交液是上述预杂交液中加入终浓度为1.0ug/ml的cRNA探针配置成的;

(h)杂交后用1 x SSC洗涤杂交的组织切片,37℃,2次,每次10分钟;

(i)用2 x SSC洗涤上述的组织切片,37℃,2次,每次10-15分钟;

(j)用10ug/ml的RNase A处理,37℃,1次,每次30-40分钟;

(k)用2 x SSC洗涤上述的组织切片,室温,1次,每次10分钟;

(l)用0.01mol/L PBS洗涤上述的组织切片,室温,1次,每次10分钟;所述0.01mol/L PBS是2.9克磷酸氢二钠,0.29克磷酸二氢钠,9.0克氯化钠用超纯水定容至1L配置的磷酸缓冲液;

(m)按1∶2000的抗体效价,在PBS溶液中加入Anti-Digoxigenin-AP抗体,对洗涤后的组织切片进行孵育,室温,放置过夜;

(n)将经过上步抗体孵育的组织片用0.01mol/L PBS洗涤,于室温,清洗3次,每次10-15分钟;

(o)用TS9.5洗涤上述PBS洗涤后的组织片,室温,清洗2次,每次15-20分钟;所述TS9.5为是由终浓度为摩尔浓度为0.1mol/L Tris-HCl(PH9.5),摩尔浓度为0.1mol/L NaCl溶液和摩尔浓度为50mmol/L MgCL2用超纯水配制而成;

(p)将上述切片放于NBT-BCIP反应液中避光孵育4~6小时,在此过程中观察切片呈色强度;所述NBT-BCIP是一种Roche公司生产的呈色反应液;

(q)当呈色完成后,将切片用PBS清洗3次,室温,每次10-15分钟;

(r)将上述洗涤后切片表于载玻片上;

(s)晾干切片,再经过二甲苯脱色,封片,以备观察。

下载完整专利技术内容需要扣除积分,VIP会员可以免费下载。

该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息,商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于中国人民解放军第四军医大学,未经中国人民解放军第四军医大学许可,擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作,请联系【客服

本文链接:http://www.vipzhuanli.com/pat/books/201210022007.4/1.html,转载请声明来源钻瓜专利网。

×

专利文献下载

说明:

1、专利原文基于中国国家知识产权局专利说明书;

2、支持发明专利 、实用新型专利、外观设计专利(升级中);

3、专利数据每周两次同步更新,支持Adobe PDF格式;

4、内容包括专利技术的结构示意图流程工艺图技术构造图

5、已全新升级为极速版,下载速度显著提升!欢迎使用!

请您登陆后,进行下载,点击【登陆】 【注册】

关于我们 寻求报道 投稿须知 广告合作 版权声明 网站地图 友情链接 企业标识 联系我们

钻瓜专利网在线咨询

周一至周五 9:00-18:00

咨询在线客服咨询在线客服
tel code back_top