[发明专利]一种谷氨酸转运蛋白-3基因的cRNA 原位杂交探针及其制备方法无效
申请号: | 201210022007.4 | 申请日: | 2012-02-01 |
公开(公告)号: | CN102559904A | 公开(公告)日: | 2012-07-11 |
发明(设计)人: | 魏燕燕;黄静;陈晶;王亚云;李云庆;武胜昔 | 申请(专利权)人: | 中国人民解放军第四军医大学 |
主分类号: | C12Q1/68 | 分类号: | C12Q1/68;C12N15/11;C12N15/10 |
代理公司: | 西安通大专利代理有限责任公司 61200 | 代理人: | 陆万寿 |
地址: | 710032 *** | 国省代码: | 陕西;61 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 谷氨酸 转运 蛋白 基因 crna 原位杂交 探针 及其 制备 方法 | ||
1.一种谷氨酸转运蛋白-3基因cRNA原位杂交的探针,其特征在于,该探针的序列为:
5′GCTGTGCGGAAGAAAAGAACCACGTGGACAAGAGGATCACAAGATTTGTGCTGCCCGTCGGCGCCACCATCAACATGGACGGCACTGCGCTCTATGAAGCCGTGGCAGCTGTGTTCATTGCGCAGCTGAACGGCATGGACCTGAGCATTGGGCAGATCATCACGATCAGCATCACAGCCACCGCTGCTAGCATTGGAGCTGCCGGTGTGCCCCAGGCTGGCCTGGTGACCATGGTGATCGTGTTGAGTGCCGTGGGGCTGCCTGCTGAGGACGTCACCCTCATCATTGCCGT 3′。
2.如权利要求1所述探针的制备方法,其特征在于:
(1)根据谷氨酸转运蛋白-3的Gene bank序列我们设计了谷氨酸转运蛋白-3特异的引物,并且此对引物扩增出292bp的谷氨酸转运蛋白-3片段作为谷氨酸转运蛋白-3特异的探针序列;
(2)构建谷氨酸转运蛋白-3的cRNA原位杂交的探针质粒;将探针质粒转化细菌后,细菌培养后进行测序;
(3)制备谷氨酸转运蛋白-3的cRNA原位杂交探针;
(4)检测谷氨酸转运蛋白-3的cRNA探针的原位杂交。
3.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中谷氨酸转运蛋白-3特异的引物是:
上游引物是5′GCTGTGCGGAAGAAAAGAAC 3′;
下游引物是5′ACGGCAATGATGAGGGTGAC 3′。
4.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)按照如下步骤进行:
(a)将大鼠的cDNA用设计的引物进行PCR扩增;
(b)将PCR产物用TIANGEN胶回收试剂盒进行胶回收;
(c)将回收后的产物于4℃与多克隆位点两端具有T7,SP6启动子的载体进行连接;
(d)将连接好的质粒转化细菌后,细菌培养后进行测序。
5.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(3)按照如下步骤进行:
(a)步骤(2)的到的细菌测序正确后,经判断确认谷氨酸转运蛋白-3探针序列插入载体的顺序是正向的;
(b)需要使用BamH I限制性内切酶对质粒进行酶切;
(c)将酶切产物用TIANGEN胶回收试剂盒进行胶回收;
(d)用SP6RNA聚合酶对探针进行体外转录标记。
6.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(4)按照如下步骤进行:
(a)将大鼠用0.4%戊巴比妥钠深麻后,经左心室插管至升主动脉,用0.01mol/L的DEPC-PBS的快速冲洗去除血液,再以4%多聚甲醛灌注固定;所述的0.01mol/L DEPC-PBS是2.9克磷酸氢二钠,0.29克磷酸二氢钠,9.0克氯化钠用超纯水定容至1L后,再加入体积百分比为0.1%的DEPC 1ml放置过夜后,高压灭菌制成的磷酸盐缓冲液;所述4%的多聚甲醛是40.0克多聚甲醛加入500.0ml蒸馏水加热使之解聚溶解后,再加入500.0ml的0.2mol/L PB缓冲液定容至1000ml;所述0.2mol/L PB缓冲液是用29.01克磷酸氢二钠,2.96克磷酸二氢钠加超纯水定容至500ml配制而成;
(b)取材后进行脑组织的后固定:于4℃,用4%的多聚甲醛后固定24小时;
(c)将固定好的组织进行切片:将组织切成25~30μm组织切片,并将切好的切片保存于0.01mol/L的DEPC-PBS中,放于4℃冰箱备用;
(d)将切好的组织片用0.01mol/L的DEPC-PBS清洗1次,室温,每次5-10分钟;
(e)将上述清洗过的片子用5 x SSC清洗2次,室温,每次5-10分钟;所述5 x SSC是由20 x SSC用超纯水稀释的,20 x SSC为一种柠檬酸缓冲液;
(f)将5 x SSC清洗后的组织片浸入预杂交液中,于55℃,在杂交炉孵育1-2小时;所述预杂交液是由5ml的去离子甲酰胺,2.5ml的20 x SSC溶液,200μl的50 x Denhardt’s溶液,50μl的浓度为200mg/ml的Heparin溶液,100μl的浓度为10mg/ml的tRNA溶液,100μl的浓度为10%的CHAPS溶液,100μl的浓度为10%的Tween-20溶液,100μl的浓度为0.5mol/L的pH8.0的EDTA溶液和1.85ml的DEPC-H2O混合配制而成;所述50 x Denhardt’s为一种常用的杂交试剂;所述200mg/ml的Heparin为200mg的Heparin粉末溶于1ml的DEPC-H2O中配制而成;所述10mg/ml的tRNA为10mg的tRNA粉末溶于1ml的DEPC-H2O中配制而成;所述10%的CHAPS为1g的CHAPS溶于1ml的DEPC-H2O中配制而成;所述10%的Tween-20为100μl的Tween-20溶于900μl的DEPC-H2O中配制而成;所述0.5mol/L的pH8.0的EDTA为186.1g二水乙二胺四乙酸二钠加入800ml的DEPC-H2O中在磁力搅拌器上剧烈搅拌,用NaOH调pH值至8.0然后定容至1L配制而成高压灭菌备用;所述DEPC-H2O为1L超纯水加入体积百分比为0.1%的DEPC 1ml,放置过夜并高压灭菌处理后的水;
(g)将预杂交孵育后的组织切片浸入杂交液中,于55℃,在杂交炉中孵育16-20小时;所述杂交液是上述预杂交液中加入终浓度为1.0ug/ml的cRNA探针配置成的;
(h)杂交后用1 x SSC洗涤杂交的组织切片,37℃,2次,每次10分钟;
(i)用2 x SSC洗涤上述的组织切片,37℃,2次,每次10-15分钟;
(j)用10ug/ml的RNase A处理,37℃,1次,每次30-40分钟;
(k)用2 x SSC洗涤上述的组织切片,室温,1次,每次10分钟;
(l)用0.01mol/L PBS洗涤上述的组织切片,室温,1次,每次10分钟;所述0.01mol/L PBS是2.9克磷酸氢二钠,0.29克磷酸二氢钠,9.0克氯化钠用超纯水定容至1L配置的磷酸缓冲液;
(m)按1∶2000的抗体效价,在PBS溶液中加入Anti-Digoxigenin-AP抗体,对洗涤后的组织切片进行孵育,室温,放置过夜;
(n)将经过上步抗体孵育的组织片用0.01mol/L PBS洗涤,于室温,清洗3次,每次10-15分钟;
(o)用TS9.5洗涤上述PBS洗涤后的组织片,室温,清洗2次,每次15-20分钟;所述TS9.5为是由终浓度为摩尔浓度为0.1mol/L Tris-HCl(PH9.5),摩尔浓度为0.1mol/L NaCl溶液和摩尔浓度为50mmol/L MgCL2用超纯水配制而成;
(p)将上述切片放于NBT-BCIP反应液中避光孵育4~6小时,在此过程中观察切片呈色强度;所述NBT-BCIP是一种Roche公司生产的呈色反应液;
(q)当呈色完成后,将切片用PBS清洗3次,室温,每次10-15分钟;
(r)将上述洗涤后切片表于载玻片上;
(s)晾干切片,再经过二甲苯脱色,封片,以备观察。
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