[发明专利]一种EAAT2基因cRNA原位杂交的探针及其设计方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物医学领域，涉及一种探针及其设计方法，尤其 是一种EAAT2基因cRNA原位杂交的探针及其设计方法。

背景技术：

谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统最重要的神经递质，在体内主 要与亲离子性和亲代谢性两种谷氨酸受体家族结合发挥活化作用。 谷氨酸如果在细胞外浓度过高，过度兴奋谷氨酸受体可导致神经细 胞死亡，由于细胞外没有能分解谷氨酸的酶，释放的谷氨酸几乎完 全依赖神经元以及神经胶质细胞膜上的谷氨酸转运蛋白(EAAT)的摄 取来保持浓度的相对稳定，同时EAAT也为体内很多代谢途径提供 谷氨酸来源。谷氨酸转运蛋白分高亲合力和低亲合力转运蛋白两 种，高亲合力转运蛋白都作用于依赖钠-钾的L-谷氨酸，L-和D-天冬 氨酸，所以也称为钠-钾谷氨酸转运蛋白或兴奋性氨基酸转运蛋白 (Excitatory amino acid transporter，EAAT)。目前已有五种被克隆，它 们是EAAT1(GLAST，Glutamate-aspartate transporter)，EAAT2 (GLT，glial glutamate transporter)，EAAT3(EAAC，excitatory  amino acid Carrier)，EAAT4和EAAT5。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种EAAT2基因cRNA原位杂交的探针 及其设计方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来解决的：

一种EAAT2基因cRNA原位杂交的探针，该探针的序列为：

5′AACCAAGGCAGTCATCTCCCTGTTGAATGAGACCATGAAT GAGGCCCCTGAAGAAACTAAGATCGTTATCAAGAAGGGCCTGG AGTTCAAGGACGGGATGAATGTCTTAGGTCTGATTGGATTCTTT ATTGCTTTCGGCATTGCCATGGGGAAGATGGGTGAGCAGGCCA AGCTGATGGTGGAGTTCTTCAACATTCTGAACGAGATTGTCATG AAGTTAGTGATCATGATCATGTGGTATTCCCCGCTGGGTATCGCC TGCTTGATCTGTGGGAAGATCATCGCCATCAAGGACTT 3′。

所述探针的设计方法：

(1)根据EAAT2的Gene bank序列我们设计了EAAT2特异的引物， 并且此对引物扩增出278bp的EAAT2片段作为EAAT2特异的探针序 列；

(2)构建EAAT2的cRNA原位杂交的探针质粒；将探针质粒转化 细菌后，细菌培养后进行测序；

(3)EAAT2的cRNA原位杂交探针；

(4)检测EAAT2的cRNA探针的原位杂交。

所述步骤(1)中EAAT2特异的引物是：

上游引物是5′CAACCAAGGCAGTCATCTCC 3′；

下游引物是5′AAGTCCTTGATGGCGATGAT 3′。

所述步骤(2)按照如下步骤进行：

(a)将大鼠的cDNA用设计的引物进行PCR扩增；

(b)将PCR产物用TIANGEN胶回收试剂盒进行胶回收；

(c)将回收后的产物于4℃与多克隆位点两端具有T7，SP6启动子 的载体进行连接；

(d)将连接好的质粒转化细菌后，细菌培养后进行测序。

所述步骤(3)按照如下步骤进行：

(a)步骤(2)得到的细菌测序正确后，经判断确认EAAT2探针序列 插入载体的顺序是正向的；

(b)需要使用BamH I限制性内切酶对质粒进行酶切；

(c)将酶切产物用TIANGEN胶回收试剂盒进行胶回收；

(d)用SP6 RNA聚合酶对探针进行体外转录标记。

所述步骤(4)按照如下步骤进行：