[发明专利]一种新生大鼠海马神经元原代培养的培养液及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种新生大鼠海马神经元原代培养的培养液，其特征在于：该培养液为在基础培养液中加入1、6二磷酸果糖、果糖和营养添加剂；其中，每升基础培养液中加入1-10mmol的1、6二磷酸果糖、2-20mmol的果糖，其中所述基础培养液为Neurobasal Medium。

2.根据权利要求1所述的新生大鼠海马神经元原代培养的培养液，其特征在于，所述1、6二磷酸果糖与果糖质量浓度比为1:2。

3.根据权利要求1所述的新生大鼠海马神经元原代培养的培养液，其特征在于每升基础培养液中加入如下组分的营养添加剂：10-20μg碱性成纤维细胞生长因子，6-15mg ATP，30-50U辅酶A，0.1-1g两性霉素B，5-50mg胰岛素，0.42-0.83mg硫酸亚铁，5-50mg人转铁蛋白和20-60mg维生素混合液。

4.根据权利要求3所述的新生大鼠海马神经元原代培养的培养液，其特征在于，维生素混合液为生物素、氯化胆碱 、泛酸钙、叶酸、肌醇、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12 和烟酰胺的混合物。

5.根据权利要求4所述的新生大鼠海马神经元原代培养的培养液，其特征在于，所述每升基础培养液中，维生素混合液由如下含量的各组分构成，

生物素      0.001-0.01mg/L

氯化胆碱    5-20mg/L

泛酸钙      2-10mg/L

叶酸        0-5 mg/L

肌醇        5-20 mg/L

维生素B1   2-10 mg/L

维生素B2   0.1-0.5mg/L

维生素B6   2-10mg/L

维生素B12  0.2-1.0 mg/L

烟酰胺      2-5 mg/L。

6.根据权利要求1所述的新生大鼠海马神经元原代培养的培养液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤，

A：按所述配比取1、6二磷酸果糖、果糖加入基础培养液Neurobasal Medium中，充分搅拌均匀；

B：在上述溶液中加入营养添加剂；

C：以1-10当量浓度的氢氧化钠调pH 7.4-8.0；

D：层流细胞培养室抽滤消毒，4℃储存备用；

E：最后加入所述量的ATP和辅酶A。

7.根据权利要求1所述的新生大鼠海马神经元原代培养的培养液的制备方法，其特征在于，每升基础培养液中加入如下组分的营养添加剂：10-20μg碱性成纤维细胞生长因子，6-15mg ATP，30-50U辅酶A，0.1-1g两性霉素B，5-50mg胰岛素，0.42-0.83mg硫酸亚铁，5-50mg人转铁蛋白和20-60mg维生素混合液。

8.新生大鼠海马神经元原代培养的方法，其特征在于具有以下步骤：

①制备如权利要求1-5之一所述的海马神经元原代培养的培养液；              

②取材、消化：新生大鼠断头取脑，在冰上钝性拨离出脑组织，去除血管膜，完整取出海马组织；剪碎成约1mm3的小块，加入约与组织等体积的浓度为2-4 mg/mL的木瓜酶，混匀，37℃消化5-15min，用含10%胎牛血清DMEM/F12培养基终止消化，并加入10μl DNaseⅠ打开絮状黏连，吸管轻轻吹打组织块分散细胞；

③制备单细胞悬液：将步骤②细胞悬液经400目尼龙网过滤，1000r/min离心10min去上清，加10%胎牛血清的DMEM/F12重悬，调细胞密度为1～5×105个细胞/mL浓度的单细胞悬液；

④接种、培养：将步骤③制备的单细胞悬液加入多聚L-赖氨酸的培养板中，置于37℃、5%CO2培养箱培养；24h后将原来含10%胎牛血清DMEM/F12培养基更改为步骤①制备的海马神经元原代培养的培养液，每隔2d换液1次，每次更换一半培养液。