[发明专利]一种用改良STELA法测细胞中最短端粒长度的方法

说明书

技术领域   本发明涉及一种用改良STELA法测细胞中最短端粒长度的方法。

  背景技术

端粒（Telomere）是一段DNA重复序列，位于染色体末端，可以保持染色体的完整性。1990年，Harley等证实端粒的长度可以随着细胞分裂次数的增多而逐渐变短。这一发现在端粒和细胞衰老之间建立了紧密的联系。端粒重复序列的长度可能起着一种分子钟（molecular clock）的作用。不同年龄的人的体细胞的寿命明显不同，其端粒的长度也不相同。是随着年龄的增长而缩短。来自新生儿的体细胞可在体外传代培养80—90代，来自70岁老人的体细胞在体外只能传代培养20～30代，而且端粒的重复序列长度也缩短很多。

端粒酶（Telomerase）是细胞中负责端粒延长的一种酶，是基本的核蛋白逆转录酶，可将端粒DNA加至真核细胞染色体末端。端粒在不同物种细胞中对于保持染色体稳定性和细胞活性有重要作用，端粒酶能延长缩短的端粒（缩短的端粒其细胞复制能力受限），从而增强体外细胞的增殖能力。

但是，在正常人体细胞中，端粒酶的活性受到相当严密的调控。实验证明，体细胞里没有端粒酶的活性，所以体细胞每分裂一次，端粒也就缩短一些。随着细胞不断地进行分裂，端粒的长度将越来越短，当达到一个临界长度时，细胞染色体会失去稳定性，使细胞不能再进行分裂而进入凋亡（apoptosis）。端粒的长度决定了细胞的寿命，因此可用丢失的端粒重复序列的长度来推测细胞有丝分裂的次数，所以端粒被称为分子钟或有丝分裂钟（mitotic clock）。端粒除了涉及到染色体稳定性，细胞的衰老和死亡外，还与肿瘤的发生密切相关。在人体内的各种细胞中，生殖细胞和干细胞染色体的末端比体细胞染色体的末端长出几千个碱基对，并且在这两类细胞里能检测到端粒酶的活性。除此之外，其他所有体细胞里都未测得端粒酶的活性。惟一的例外是来源于体细胞的恶性肿瘤细胞却又重新出现了端粒酶活性，发挥其合成端粒重复序列的功能，以补偿正常的端粒序列丢失，使端粒的重复序列不会达到导致细胞死亡的临界长度，从而获得细胞的“永生性”(immortality)。这样，恶性肿瘤细胞在体内或体外都能无限制地分裂增殖。

上文提到的端粒长度缩短指的是所有染色体末端端粒的平均长度。近年来，很多实验观察开始质疑端粒的平均长度与衰老之间的联系。一些研究小组提出了于端粒相关的细胞衰老是由单一或某几个短端粒引起的观点。这一观点的正确性也被越来越多的实验数据所证明。

目前，研究端粒长度主要是应用TRF法（mean length of telomere restriction fragments）。但是，这个方法测量的是细胞内端粒的平均长度，而无法测量其中短端粒所占的比例，因此有很大的局限性。

单个端粒长度分析(STELA，single telomere length analysis) 是在单个染色体水平上基于PCR的端粒测量方法。第1步是“telorette”(在与端粒G悬突不配对的20个核苷酸后有7个同源的TTAGGG接头)的退火. 第2步是将“telorette”连接到富C链5末端.此后用识别telorette尾巴的teltail引物同亚端粒上游引物进行PCR扩增。在研究这个区域的多态现象时, 上游引物可以是特异的等位基因。 STELA最先被用于分析人类X染色体短臂。最近对秀丽隐杆线虫的端粒和沃纳综合征的成纤维细胞的端粒的研究表明, 在单个染色体水平上STELA的分析有很高的可靠性。STELA的PCR扩增具有高度的端粒特异性, 用STELA测量人类成纤维细胞的XpYp端粒长度始终比TRF的平均值小, 且这两者成线性关系, 说明STELA没有包括亚端粒长度。

另外，有一些手段可以比较精确的研究染色体中短端粒的情况，例如基于荧光原位杂交（Q-FISH）的技术。但是这些技术手段都或多或少存在一些不足之处，无法作为高效精确地研究或检测最短端粒的合适手段。

 

发明内容

发明目的：

本专利涉及一种改良的STELA法，可以有效快速地检测研究细胞染色体短端粒长度和所占的比例。

技术方案

一种用改良STELA法测细胞中最短端粒长度的方法，其特征在于按步骤实现：

A、限制性内切酶消化：细胞中提取的gDNA经过MseI和NdeI两种限制性内切酶酶切（摩尔比1：1）；