[发明专利]一种检测ADAMTS13酶活性的荧光底物及检测方法

权利要求书

1.一种检测ADAMTS13酶活性的荧光底物，其特征在于，包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，并且其氨基酸序列N端第4位和第15位的半胱氨酸的巯基结合有荧光基团。

2.根据权利要求1所述荧光底物，其特征在于，所述荧光基团为荧光素-5-马来酰亚胺。

3.一种检测ADAMTS13酶活性的荧光底物的制备方法，其特征在于，制备具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白，然后用能与巯基结合的荧光基团修饰蛋白即得。

4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述制备具有编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白的方法具体包括：

步骤1：制备编码VWF73的核苷酸序列，与T载体连接，获得重组T载体；

步骤2：双酶切步骤1所得的重组T载体，收集VWF73片段，与pQE30表达载体双酶切所得的大片段重组，获得pQE30-VWF73重组载体；

步骤3：将步骤2所得的pQE30-VWF73重组载体中的VWF73片段N端第4位和第15位的氨基酸定点突变为半胱氨酸，然后再删除pQE30-VWF73重组载体中VWF73片段N端额外氨基酸序列GS，获得pQE30-VWF73突变重组载体；

步骤4：将获得的pQE30-VWF73突变重组载体转化宿主细胞，诱导蛋白表达，分离纯化表达的蛋白即得。

5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，步骤1所述制备编码VWF73片段的核苷酸序列具体为用具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的下游引物扩增。

6.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，步骤3具体包括以下步骤：

A：以pQE30-VWF73重组载体为模板，用具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列的下游引物扩增，甲基酶消化模板，获得pQE30-VWF73重组载体中VWF73片段N端的第4位突变为半胱氨酸的质粒；

B：以pQE30-VWF73重组载体中VWF73片段N端的第4位突变为半胱氨酸的质粒为模板，用具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列的下游引物扩增，甲基酶消化模板，获得pQE30-VWF73重组载体中VWF73片段N端第4位和第15位突变为半胱氨酸的质粒；

C：以pQE30-VWF73重组载体中VWF73片段N端第4位和第15位突变为半胱氨酸的质粒为模板，用具有SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列的下游引物扩增，甲基酶消化模板，获得删除VWF73片段N端额外氨基酸序列GS的pQE30-VWF73-突变重组载体。

7.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，步骤2所述双酶切为Bam HI和Hind III双酶切。

8.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，步骤4所述宿主细胞为大肠杆菌M15菌株。

9.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述能与巯基结合的荧光基团为荧光素-5-马来酰亚胺。

10.根据权利要求9所述制备方法，其特征在于，所述用能与巯基结合的荧光基团修饰蛋白为取具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白，加入3倍摩尔量的磷酸三(β-氯乙基)酯和10倍摩尔量的荧光素-5-马来酰亚胺，4℃暗室反应过夜，之后装入透析袋，用pH7.520mmol/L Tris-HCl缓冲液透析过夜，然后用聚乙二醇-20000浓缩蛋白即得。

11.权利要求1所述荧光底物在检测ADAMTS13酶活性中的应用。

12.一种检测ADAMTS13酶活性的方法，其特征在于，取待测血浆样品与过量的权利要求1所述荧光底物在反应缓冲液中混合，然后在所述荧光底物所结合荧光基团相应的激发光波长和发射光波长下，检测反应体系的荧光强度，按照标准曲线法计算待测血浆样品中ADAMTS13酶活性。

13.根据权利要求12所述检测方法，其特征在于，所述荧光底物用量为2.1μmol。