[发明专利]低温处理法提高表皮干细胞牙向分化效率的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种诱导表皮干细胞牙向分化的方法，具体涉及采用低温处理法提高动物上皮组织来源的表皮干细胞向成牙釉质细胞分化效率的方法。

背景技术

牙齿不仅能够咀嚼食物、帮助发音，而且对面容有很大影响。然而人类遗传性的牙齿缺陷却是一种比较普遍的现象，同时，随着年龄的增长，几乎所有人都有不同程度的牙齿缺陷甚至缺失。牙齿特别是釉质部分，一旦缺失自身将无法完成修复和再生。因此，人类牙齿的再生是一项极具应用前景、社会效益和市场价值的研究工作。

根据牙齿发育的特性，利用成体干细胞进行牙齿器官再生同样需要上皮源性的干细胞和间充质源性的干细胞的同时参与。已有研究工作表明，具有诱导成牙潜能的小鼠E11.5（E12之前）的牙胚上皮与间充质来源的成体干细胞，如骨髓干细胞、牙髓干细胞和牙周膜干细胞等重组构建嵌合体，嵌合体能够发育为具有类似牙齿的结构，证明利用间充质来源的成体干细胞诱导成牙已经在理论上得到解决。但是，由于上皮来源的牙釉质细胞在牙齿萌发过程中已经凋亡，已经不可能从成体牙齿获得相应的上皮源性干细胞，所以必须从其它器官中寻找成体上皮源性干细胞。然而迄今为止，仍未找到一种合适的成体干细胞作为种子细胞，诱导其向牙上皮分化并且形成牙釉质细胞。因此，获得上皮源性的成体干细胞并诱导其向成牙釉质细胞分化是目前人类牙齿再生工程的瓶颈工作之一。

表皮干细胞（keratinocyte stem cells, KSC）来源于皮肤表皮的基底层，属于上皮源性的干细胞。目前已经证实表皮干细胞具有多向分化的潜能，而且已经在严重皮肤灼伤、慢性皮肤创伤和基因治疗等临床治疗上得到有效地应用。因此可以尝试利用其成熟的培养和再生技术，为牙齿再生研究提供一种替代牙上皮的成体干细胞。

本发明人前期以人表皮干细胞为材料，在培养温度为37℃情况下，与具有诱导成牙潜能的小鼠E13.5牙胚间充质(E12之后)重组，在嵌合体中添加FGF8生长因子能够诱导人表皮干细胞向成牙釉质细胞分化，相关数据发表在Developmental Biology 期刊（SCI收录，影响因子4.7； Induction of human keratinocytes into enamel- secreting ameloblasts. Developmental Biology. 2010, 344:795-799.），但是嵌合体形成牙齿结构的效率（成牙率）约为28%，其中表皮干细胞分化形成成釉质细胞的效率（成釉率）约为31%，效率不高。

发明内容

本发明目的是提供一种采用低温处理法将表皮干细胞于24～27℃培养箱低温处理以提高诱导表皮干细胞牙向分化的成牙效率的方法。

为实现本发明的目的，采用的技术方案是：

1、表皮干细胞的分离、培养

①将皮肤组织放入含4% 青霉素/链霉素的PBS中清洗两次，然后在解剖镜下剪去皮下脂肪结缔组织；

②将剪去皮下脂肪结缔组织的其余皮肤组织放入PBS清洗三次；

③清洗后将皮肤组织放入培养皿中，用棉球沾取碘酒进行上下涂拭消毒处理，然后立即放入70%乙醇去碘，再用PBS去乙醇；

④将步骤③中经消毒处理的皮肤组织剪成2 cm×0.5 cm条状，表皮面朝上于4℃ 2 U/mL Dispase II进行第一次消化，消化时间12～14 hr；

⑤在解剖镜下用尖镊分离经消化的皮肤组织中的表皮和真皮，取表皮并放入PBS清洗；

⑥将清洗的表皮放入0.25% Trypsin/0.05% EDTA中，用弯剪将表皮剪碎，37℃下进行二次消化10～15 min；

⑦用含20% FBS 37℃的 DMEM中止消化，轻缓吹散表皮碎片；100目细胞筛过滤表皮碎片，余下细胞悬液放置于15 mL离心管；

⑧常温下100g 离心5 min；

⑨弃上清液，用KSFM轻缓重新悬浮沉淀的细胞，接种于6 cm培养皿中，置于37℃ 5%CO2培养箱培养，培养时间为18～24hr；

⑩吸弃上清液，加入新鲜KFSM；之后隔天半量更换新鲜的KFSM，当表皮干细胞密度为50%以上时每天更换新鲜的KFSM，至80%时传代。

2、低温处理

表皮干细胞传代后，于37℃ 3%～8%CO2培养箱培养1.5～3天，待表皮干细胞贴壁稳定后，放入24～27℃ 3%～8% CO2培养箱低温处理2～4天。

3、牙胚间充质的分离

① 取E13.5的小鼠胚胎，在解剖镜下利用尖镊取下胚胎头部并分离下颌；