[发明专利]来源于抗CypA骆驼科动物的重链VHH抗体基因、编码多肽及其应用

说明书

所属技术领域

本发明涉及生物技术及医药领域，尤其是抗亲环素A(cyclophilin A，CypA)抗原的羊驼重链VHH抗体的基因和多肽，以及所述基因和多肽的应用。 

背景技术

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)全球发病率1％，我国RA患者已逾500万人。RA患者致残率高，发病的最初2年内，约有75％的患者出现关节损害，80％的患者20年后关节变形残疾，部分病情进展迅速，甚至导致死亡。因此，RA的治疗一直是医学界关注的焦点。近年来，RA治疗药物不断发展，尤其是一系列新的生物制剂的应用显著改善了RA患者的滑膜炎症，减缓了关节损伤。然而，目前针对RA的治疗药物主要以炎性细胞因子和炎性细胞为靶点，均不能终止RA的软骨和骨侵袭，因此，发现新的治疗RA的靶点仍是RA治疗的发展趋势。 

亲环素A(CypA)，一种广泛存在的细胞内蛋白，具有肽脯胺酰顺反异构酶活性。研究报道在炎症刺激下，CypA能够分泌至细胞外，促进炎症反应。RA病人的血清和滑液中存在高水平的CypA，并且其浓度与病情的严重程度密切相关。在RA关节滑膜层内，CypA主要由巨噬细胞及内皮细胞表达，诱导TNF-α、IL-8、MCP-1和IL-1β等促炎性细胞因子的表达，同时CypA通过核转录因子NFκB刺激巨噬细胞表达MMP-9，促进关节软骨的降解。以上研究表明CypA作为一种炎症调节分子与RA的发病机制有密切关系。目前，以CypA为治疗靶点的抗体类药物仍未见报道。 

重链抗体是在骆驼血清中发现的一类天然缺失轻链的免疫球蛋白，克隆重链抗体的可变区得到的抗体被称为VHH抗体。研究发现，VHH抗体具有易表达、可溶性好、稳定性强等优点。它的最大特点是能够识别独特构象的抗原表位，与传统抗体相比，它的CDR3区较长，能形成丰富的抗原结合构象，适合从中筛选酶的抑制剂、受体的激动剂或拈抗剂。Marc Lauwereys等得到的VHH抗体片段能够抑 制碳酸酐酶和淀粉酶的活性。VHH抗体还可作为报告分子用于临床上的组化筛选；还能够作为生物传感器的捕获试剂；将VHH抗体与毒素、酶等连接构成的免疫融合物，组织穿透力强、清除快，是理想的药物载体；VHH抗体还可作为细胞内抗体。已有研究表明VHH抗体作为一种小型化的基因工程抗体在基础研究及药物开发领域有广阔的应用前景。 

噬菌体抗体库技术是迄今发展最成熟、应用最广泛的抗体库技术，该技术通过构建抗体文库，然后将抗体基因表达于噬菌体表面，用固相化抗原对表达产物的载体进行淘筛，能够获得任何一种高度特异性的抗体。 

发明内容

本发明的一个目的在于提供来源于抗CypA骆驼科动物的重链VHH抗体基因及其编码的多肽，其重组后可表达出能够与CypA特异性结合的抗体活性片段。 

本发明的另一个目的在于所述抗体基因或多肽在制备治疗类风湿关节炎相关炎性疾病方面药物中的应用。 

根据本发明的一个方面，本发明涉及抗CypA重链VHH抗体的基因。本发明所述的抗CypA重链VHH抗体的基因是从CypA免疫羊驼所收集的外周血淋巴细胞所构建的抗体库中用我们原核表达的CypA抗原筛选获得。获得1株阳性克隆，命名为Escherichia coli pCANTAB5E-A1-HB2151(保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：中国武汉武汉大学保藏号：CCTCC NO：M 2011482，保藏日期：2011年12月26日)，其诱导表达的抗体活性片段命名为A1。经过序列测定和在NCBI中BLAST分析后，确认所述的来源于抗CypA骆驼科动物的重链VHH抗体基因，具有序列表<400>1的基因序列，其编码的多肽具有序列表<400>2的氨基酸序列。上述基因重组后能够表达出与CypA特异性结合的抗体活性片段。 

所述骆驼科动物选自羊驼。 

本发明所克隆的重链VHH抗体基因应用因特网上的基因序列数据库NCBI对所得序列进行同源性比较和其胚系基因来源分析表明，所获得基因确实来自骆驼胚系基因，和现有报道的各类抗体基因序列均不完全一致。 

根据本发明的另一方面，本发明还涉及所述抗体基因及其编码多肽在制备治疗类风湿关节炎相关炎性疾病药物中的应用。