[发明专利]一种产甜叶菊糖基转移酶UGT76G1的基因工程菌及其应用

权利要求书

1.一种产甜叶菊糖基转移酶UGT76G1的基因工程菌，其特征在于它是将UGT76G1编码基因插入PYes2载体的EcoRI和XhoI酶切位点之间，构建了重组质粒，再将重组质粒导入表达宿主酿酒酵母Saccharomyces cerevisiaeYPH499中得到的工程菌；

其中，所述的UGT76G1编码基因为GenBank，No.GenBank：AY345974.1，该基因序列命名为UGT。

2.权利要求1所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

1)用限制性内切酶EcoR I和Sal I双酶切UGT基因片段和PYes2载体，连接UGT基因片段纯化产物与PYes2载体，得到重组质粒PYes2-UGT；

2)将重组质粒PYes2-UGT转化至DH5α感受态细胞，得到重组大肠杆菌DH5α-PYes2-UGT，选取阳性克隆；

3)将鉴定后的阳性克隆的质粒导入酿酒酵母Saccharomyces cerevisiaeYPH499中，得到基因工程菌YPH499-PYes2-UGT。

3.权利要求1所述的基因工程菌的诱导表达方法，其特征在于，以半乳糖为诱导剂诱导基因工程菌产酶。

4.根据权利要求3所述的基因工程菌的诱导表达方法，其特征在于，将基因工程菌按2～5％接种量接种到碳源为20g/L葡萄糖的培养基上，培养8～16h，然后收集菌体，将菌体转移到碳源为20g/L半乳糖的培养基中诱导，诱导时间为48～60h；所述的碳源为20g/L葡萄糖的培养基配方为：6.7g/L YNB，20g/L葡萄糖，0.1g/L腺嘌呤，0.1g/L精氨酸，0.1g/L半胱氨酸，0.1g/L亮氨酸，0.1g/L赖氨酸，0.1g/L苏氨酸，0.1g/L色氨酸，0.05g/L天冬氨酸，0.05g/L组氨酸，0.05g/L异亮氨酸，0.05g/L甲硫氨酸，0.05g/L苯丙氨酸，0.05g/L脯氨酸，0.05g/L丝氨酸，0.05g/L酪氨酸，0.05g/L缬氨酸；所述的碳源为20g/L半乳糖的培养基配方为：6.7g/L YNB，20g/L半乳糖，0.1g/L腺嘌呤，0.1g/L精氨酸，0.1g/L半胱氨酸，0.1g/L亮氨酸，0.1g/L赖氨酸，0.1g/L苏氨酸，0.1g/L色氨酸，0.05g/L天冬氨酸，0.05g/L组氨酸，0.05g/L异亮氨酸，0.05g/L甲硫氨酸，0.05g/L苯丙氨酸，0.05g/L脯氨酸，0.05g/L丝氨酸，0.05g/L酪氨酸，0.05g/L缬氨酸。

5.权利要求1所述的基因工程菌在生产莱鲍迪甙A中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，利用全细胞催化法，将甜菊甙转化为莱鲍迪甙A。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，以诱导表达后的基因工程菌为全细胞催化剂，通过加入表面活性剂改变细胞的通透性，以甜菊甙和葡萄糖为底物，添加镁离子以及调节代谢物质，反应得到莱鲍迪甙A。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，基因工程菌的用量按湿菌体计为2g/L；葡萄糖的用量为20g/L；甜菊甙的用量为1g/L；所述的表面活性剂为普郎尼克F-68，用量为1～10g/L；镁离子使用MgCl₂，用量为1～10g/L。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的调节代谢物质为UMP、丁二酸、乳清酸或柠檬酸，UMP用量为0.5～3g/L，丁二酸用量为5～10g/L，乳清酸用量为1～5g/L，柠檬酸用量为10～20g/L。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的反应在磷酸钾缓冲液体系中完成，反应pH6.8～7.8，反应温度25～42℃，反应时间12h～96h。