[发明专利]一种石斑鱼α干扰素衍生物的制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种石斑鱼α干扰素衍生物的制备方法与应用，属于蛋白质类药物修饰领域。

背景技术

我国海域中有1700多种鱼类，种质资源丰富，品种多样，但制约鱼类养殖的病毒性疾病已成为限制鱼类养殖的最大障碍，并且由于鱼类不同于陆地动物，其通过疫苗预防控制鱼类疾病的方法受到接种方式、扩散方式等的多方面制约。因此，通过鱼类干扰素来控制病毒病已逐步成为首选。

但由于蛋白质类药物自身的一些缺点制约了其进一步发展：①稳定性差，易被胃肠道内蛋白水解酶水解，难以口服给药；②较高的免疫原性，易引起发热、过敏等不良反应；③半衰期短，进入机体后易被循环系统清除，生物利用度低，频繁给药增加了工作量且造成极大地痛苦。为了提高疗效，延长半衰期，降低免疫原性等，国内外学者对干扰素等蛋白质类药物的修饰技术进行了深入的研究，包括脂质体、多糖缓释技术，以及基因突变，共价修饰等，其中，聚乙二醇(PEG)共价修饰技术能有效改善药物体内分布和药动学性质，是近十几年来应用较广的改进蛋白质类药物药动学性质的新技术，并在人类已广泛应用于临床。

聚乙二醇是由环氧乙烷与水或乙二醇不断加成聚合而成的高分子化合物。有学者将PEG注射小鼠做实验发现PEG为基本无毒的化学物质，且广泛应用于化妆品、食品和制药等行业。聚乙二醇易溶于水及乙醚、己烷等有机溶剂，在水溶液中，PEG为高度水合的聚合物，由于其具有高度灵活的骨架以及和水分子的高度结合性，PEG流体动力学体积为相近分子量水溶性蛋白分子的5到10倍，并且，当PEG与蛋白结合后，对这些蛋白的性质几乎没有太大的影响，但却可以在很大程度上提高这些蛋白的溶解度和分子量。由于普通聚乙二醇末端为活性很低的羟基，需要在复杂条件才能够发生与蛋白质类药物的共价结合，对蛋白质类药物的活性造成一定的损失，且不利于大批量生产纯化。

发明内容

本发明的目的是提供一种石斑鱼α干扰素衍生物的制备方法与应用。

该石斑鱼α干扰素衍生物的制备方法，包括以下步骤：

1)用氨基保护剂封闭石斑鱼α干扰素中赖氨酸残基的ε氨基，得到ε氨基被封闭的石斑鱼α干扰素；

2)使所述ε氨基被封闭的石斑鱼α干扰素的位于氨基端的α氨基和醛基化的单甲氧基聚乙二醇发生亲核取代反应；反应完毕后，去除所述氨基保护剂，得到所述石斑鱼α干扰素衍生物；所述石斑鱼α干扰素衍生物为石斑鱼α干扰素的α氨基与醛基化的单甲氧基聚乙二醇发生亲核取代反应形成酰胺键后生成的化合物，所述石斑鱼α干扰素衍生物分子量为38KD；

所述石斑鱼α干扰素的分子量为18.2KD，其氨基酸全序列见序列表序列2。

所述步骤2)中所述醛基化的单甲氧基聚乙二醇具体可为丙醛基修饰的单甲氧基封端的直链聚乙二醇，分子量为20KD。

所述步骤1)中所述氨基保护剂为二甲基马来酸酐，其用量为所述石斑鱼α干扰素氨基端的α氨基和赖氨酸残基的ε氨基的摩尔数之和的3-5倍，或具体可为0.2g所述石斑鱼α干扰素使用0.0664g二甲基马来酸酐或1g所述石斑鱼α干扰素使用0.332g二甲基马来酸酐；所述封闭是在0℃，pH值为8.5的磷酸盐缓冲溶液中进行；所述磷酸盐缓冲溶液的溶质为43mM的Na₂HPO₄和14mM的KH₂PO₄，溶剂为水。

所述步骤1)中所述石斑鱼α干扰素在所述磷酸盐缓冲溶液中的含量为2mg/ml-10mg/ml。

所述步骤2)中所述亲核取代反应是在如下条件下进行的：温度为37℃，使用NaBH₃CN作为催化剂；所述NaBH₃CN的用量与所述步骤1)中所述石斑鱼α干扰素摩尔数相同，或具体可为0.2g步骤1)中所述石斑鱼α干扰素使用0.032g NaBH₃CN或1g步骤1)中所述石斑鱼α干扰素使用0.16g NaBH₃CN。

所述步骤2)中所述醛基化的单甲氧基聚乙二醇的用量为步骤1)中所述石斑鱼α干扰素摩尔数的2-10倍，或具体可为0.2g步骤1)中所述石斑鱼α干扰素使用2.63g所述醛基化的单甲氧基聚乙二醇或具体可为1g步骤1)中所述石斑鱼α干扰素使用7.89g所述醛基化的单甲氧基聚乙二醇；去除所述氨基保护剂的方法是将反应体系的pH调至6.0。

由以上任一所述方法制备的石斑鱼α干扰素的衍生物也属于本发明保护的范围。

所述的衍生物可用于制备病毒抑制剂。