[发明专利]甜瓜枯萎病双侧分子标记鉴定技术

说明书

 

所属技术领域

 

本发明技术专利属于农作物生物技术育种领域，本技术利用多聚酶链式反应（PCR技术），借助与抗枯萎病基因紧密连锁的双侧分子标记ML430和MR296来扩增甜瓜基因组特定区段的DNA片段。抗病品种和感病品种所扩增的DNA片段大小有差异，通过电泳技术可以在图片上现象出来，即可根据此片段的大小判断被鉴定品种对枯萎病的抗病性。

背景技术

甜瓜枯萎病 （Fusarium　oxysperium）是瓜类严重病害之一，常造成大片瓜田植株死亡，甚至绝收，而且为害程度逐年加重。据调查，一般发病年份发病株率20%--30%，死亡株率10%左右；重发生年发病株率在30%以上，死亡株率高达30%--50%，甚至绝产(孙桂华等，2005)。该病是典型的土传病害，从苗期到成株期均可发病，结瓜中期为发病高峰，常引起瓜秧枯萎死亡，对瓜的品质、产量影响很大。

甜瓜抗病主基因的发现  目前，据报道甜瓜枯萎病的抗性主基因比较明确的主要有3个。1973年，Risser报道了两个抗病基因，分别为Fom-1 和 Fom-2。其中，Fom-1来自品种Doublon，抗甜瓜枯萎病专化型生理小种0和2，感生理小种1和1.2，Fom-2来自品种CM17187，抗生理小种0和1，感生理小种2和1.2，Joobeur等2004年克隆分离到该基因。Zink(1985)在品种Perlita FR中发现了第3个抗病基因Fom-3，该基因与Fom-1不等位，抗生理小种0和2。

甜瓜中与枯萎病连锁的分子标记的开发  Joobeur等2004年在克隆抗枯萎病主基因Fom-2的研究中，发现有多个分子标记与Fom-2紧密连锁，遗传顺序为SSR430-SSR138-Fom-2 -SSR181-SSR184-STS296-SSR180，可用来辅助筛选与鉴定Fom-2。另外，Ali Oumouloud等（2008）利用Charentais-Fom1×TRG-1551组合的F2群体，筛选到3个RAPD 标记(B17649, V01578, and V061092) 与Fom-1 连锁。

甜瓜品种抗枯萎病的鉴定方法  危害甜瓜的主要是尖镰刀菌甜瓜专化型的病原菌。 常用鉴定方法主要是苗期人工接种鉴定方法，一种是浸根法，另一种是伤根法。人工接种鉴定法有一定的局限性，能否观察到病症收到孢子浓度、接种和观察时间、鉴定期间的温度和湿度的影响。

分子标记鉴定方法能有限克服人工接种鉴定的局限性。第一，取材方便，可利用种子、根、茎、叶片等植株的任意组织器官；第二，不受苗的发育时间影响，在整个发育期均可鉴定；第三，不受发病条件的影响，直接从DNA水平上发现片段大小的差异，从而判断抗病性。但也有一定的局限性，即分子标记与抗病基因是否连锁紧密，距离越近，鉴定结果越准确，反之，则不准确，特别是利用单个标记进行鉴定时。本研究利用与抗枯萎病基因紧密连锁的双侧分子标记，可降低单侧标记由于遗传交换而发生的误判现象。

发明内容

要解决的技术问题： 本研究为了克服人工接种鉴定甜瓜枯萎病抗病性不准的缺点，即鉴定结果易受到接种用孢子浓度的大小、接种和观察时间、鉴定期间的温度和湿度的影响，从而造成错判现象。本技术发明则利用与抗枯萎病基因紧密连锁的双侧分子标记来直接扩增各品种的DNA序列，再根据抗病、感病标准鉴定寄主的DNA片段进行比较，就可鉴定品种是否有抗病性。本技术取材方便、不受发病条件的影响，鉴定准确，苗或植株是否发病都可用于鉴定。

本技术发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

（1）采用CTAB法从任意组织或器官（如种子、根、叶片、茎杆等）中提取基因组DNA；

（2）以基因组DNA为模板，利用与Fom2连锁的分子标记扩增不同品种的特异DNA片段，即PCR技术的应用；

（3）利用2-3%的琼脂糖凝胶电泳技术，分离从不同品种中所扩增的与枯萎病基因连锁的DNA片段，使不同大小的DNA片段跑在不同的位置；

（4）凝胶电泳结果成像，即将电泳好的胶放在紫外线下，经过染色的DNA可在紫外线下显现出来，从而肉眼可看到从不同品种中扩增的DNA片段跑在胶中的位置，离点样孔距离远的，是小DNA片段，离得近的，即跑的慢的就是大DNA片段；