[发明专利]一株高CO2耐受性和固定率的微藻及其选育方法

权利要求书

1.一株具有高CO₂耐受性和高固定率的微藻，其分类命名：Chlorella sp.Y-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2011年11月14日，保藏编号CGMCC No.5429。

2.权利要求1所述的微藻的选育方法，该方法包括如下步骤：

(1)出发株的筛选驯化和分离纯化：

预培养采用BBM培养基，培养时间为3周，控制培养条件为：25℃±2℃，光照强度25000Lux，光暗比12∶12；

CO₂驯化采用MBM培养基，利用CO₂混合气驯化预培养后的试样，气流体流速1L/min、光照强度25000Lux，25℃±2℃，光暗周期比为12h∶12h，驯化培养10d，CO₂混合气浓度(v/v，％，单位下同)依次为：0.035％，3％、5％和10％、15％，反复驯化4次；

对驯化之后的藻液采用平板划线分离，直至获得纯藻种，作为出发株B-1，出发株B-1的碳含量为50.726％，最佳生长浓度15％(v/v)，固定率高达2.409g/(L·d)，最高耐受浓度为60％(v/v)，适宜的培养条件范围为在温度为25℃-30℃、初始pH为5.0-6.0、15000-25000Lux的光照、气体流速为0.8-1.01L/min；

(2)目标株构建：

出发株强化培养：对出发株B-1采取渐变CO₂浓度连续试验强化培养，试验条件、步骤同出发株的驯化阶段；各培养周期CO₂浓度(v/v，％)依次增加至：5％、10％、15％、20％、30％、50％、60％、80％和100％，各培养6天时间；

基因诱变育种：诱变条件为诱变剂量致死率为70-80％、最佳诱变藻液浓度为2.5×10⁶～3.6×10⁶个/mL、诱变剂量为20W紫外灯、照射距离为25cm、辐射时间是30min；诱变后的藻液在25℃、转速141r/min、MBM培养基、30％CO₂(v/v)的气体、25000Lux光照、光暗周期比12h∶12h条件下预培养6天，按照10％的接种量每隔5d转接一次，转接三次；驯化阶段采用BBM培养基，其他条件不变，筛选出单株优良藻株，为突变株；

基因克隆：以突变株和出发株为对象，大肠杆菌(感受态细胞Top10)和PMG为质粒载体，按照《分子克隆实验指南》配置常用缓冲液及试剂，按照植物基因组DNA提取试剂盒操作提取藻株DNA，从基因库中获得小球藻属的rbcL基因序列，引物设计采用Clustal X 1.8软件进行分析；PCR反应体系的反应循环条件为94℃预变性7min、94℃变性1min、42℃复性1min、72℃延伸1min、35个循环、反应最后72℃延伸7min；取2μL PCR产物用于电泳检测，普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒切胶回收DNA片段；按pBS-T连接试剂盒进行PCR产物连接，30℃反应2h后，全部转化50μL TOP10感受态细胞中，冰上放置30min，42℃水浴热激90s，迅速转入冰浴2min，加入200μL LB液体培养基，37℃，220rmp震荡培养45min，取200μL上述转化培养物涂至含有Amp(50μg/ml)的LB平板上，待所有液体被吸收后，37℃倒置培养14h左右，出现单菌落时取出平板，挑取单克隆抗体进行检测、保种和测序；PCR法检测阳性克隆条件为94℃预变性7min，94℃变性1min，42℃复性1min，72℃延伸1min，35个循环，反应最后72℃延伸7min；采用pBS-T载体测序通用引物测序；

(3)藻株的含碳量、培养特性测定及优选目标株：

含碳量采用全自动分析仪检测，色谱条件为：载气压力80KPa，吹扫流速80ml/min，氧化体积20ml，氧气分压35KPa，采样延迟10s，运行时间360s，前级燃烧室温度920℃，炉温115℃；以半胱氨酸为标准品，样品以20mg计，仪器的检出限：N％：0.008％，C％：0.005％；

培养特性测定条件及过程：在初始pH 6.6、25℃、光照25000Lux、1.0L/min的培养条件下，控制CO₂含量分别为0.035％、5％、10％、20％、25％、30％、60％、和100％，确定CO₂最佳固定浓度和最高耐受性；采用正交试验，设置20℃、25℃、30℃、35℃等四个温度梯度，5000、15000、25000、35000和50000Lux五个光照梯度，pH5、H6、pH7、pH8四个初始pH梯度，0.7、0.8、1.0、1.1、1.2、1.50L/min六个气体流速梯度，分别以NH₄Cl、NaNO₃和NaNO₂为氮源，藻液初始吸光浓度约在0.1左右，确定适宜的温度、初始pH、光照、气流速度及氮源条件；

优选目标株：优选目标株的碳含量增至56.981％；在初始pH 6、25℃、光照25000Lux、气体流速1.1L/min、2g/L的NaNO₃为氮源时获得最佳CO₂固定浓度20％，CO₂固定率高达5.762g/(L·d)，最高耐受浓度为100％(v/v)；对环境均具有较强适应性，包括10％-35％CO₂浓度、20℃-30℃、15000-35000Lux的光照、初始pH5.0-6.5、气体流速0.8-1.10L/min、以硝酸钠为氮源的浓度在0.25-2g/L时长势良好。