[发明专利]亚洲型舞毒蛾的实时荧光PCR检测方法及检测用引物和探针

说明书

技术领域

本发明涉及林业和植物检疫技术领域，具体涉及一种亚洲型舞毒蛾的检测方法；尤其涉及一种亚洲型舞毒蛾的实时荧光PCR检测方法；此外，本发明还涉及检测亚洲型舞毒蛾的引物和探针。

背景技术

舞毒蛾Lymantria dispar(Linnaeus)属鳞翅目(Lepidoptera)、毒蛾科(Lymantriidae)、毒蛾属(Lymantria)，是世界公认的全北温带地区森林和观赏性林木害虫。舞毒蛾幼虫寄主范围广，主要有杨、柳、榆、栎、落叶松、椴、云杉等树木。主要分布在欧洲、北美、中国、日本、朝鲜，根据其形态特征、生物学习性和地理分布，舞毒蛾被分为亚洲亚种(L.disparasiatica Vnukovsk ii)、欧洲亚种(L.dispardispar(Linnaeus))和日本亚种(L.disparjaponica(Motschulsky))。亚洲亚种和日本亚种被统称为亚洲型舞毒蛾，其中亚洲亚种在我国有分布，欧洲亚种则被称为欧洲型舞毒蛾。亚洲型舞毒蛾主要分布在亚洲和部分欧洲地区，雌成虫飞行能力强，可为害约500种寄主植物。欧洲型舞毒蛾原产欧洲，于1869年由欧洲传入美国，雌成虫不能飞行，为害约250种寄主植物。

由于亚洲型舞毒蛾成虫飞行能力强且寄主范围广等原因，美国官方认为亚洲型舞毒蛾比欧洲型舞毒蛾对其威胁更大。为了防止亚洲型舞毒蛾传入美国，从1991年开始，美国在其港口及附近地区对该虫开展监测，并先后对来自俄罗斯远东、日本高风险港口的船舶实施特别检疫措施，也多次在船舶上发现舞毒蛾的卵块。2007年以来，北美植物保护组织及其成员国先后致函中国政府，并多次交涉，准备对来自中国相关港口的船舶也实施特别检疫措施。该组织最近已经出台区域标准征求意见稿《Guidelines for Regulating the Movement of Ships and Cargoes aboard those Ships from Areas Infested with the Asian GypsyMoth》。由于舞毒蛾的检疫重要性，因此，寻求快速、准确的亚洲型舞毒蛾的检测鉴定方法是现阶段检疫技术亟待解决的问题和发展的方向。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种亚洲型舞毒蛾的实时荧光PCR检测方法；为此，本发明还提供用于上述方法的检测引物和探针。利用亚洲型舞毒蛾检测引物及探针可以快速、准确地对亚洲型舞毒蛾进行检测鉴定。

本发明根据亚洲型舞毒蛾、欧洲型舞毒蛾、北美型舞毒蛾这几个地理种群的mtDNA中部分基因的序列设计特异性引物和探针，建立了亚洲型舞毒蛾的实时荧光PCR检测方法，以达到快速准确检测鉴定亚洲型舞毒蛾的目的。

在本发明的一方面，提供一种亚洲型舞毒蛾的实时荧光PCR检测方法，包括如下步骤：

(1)设计引物和探针；

该引物的序列为：

上游引物AS-F：5’-AACTTCAGGATGTCCGAAAAATCA-3’(SEQ ID NO.1)；

下游引物AS-R：5’-ACAGCTTTCCTTCTACTTTTATCTTTACCT-3’(SEQ ID NO.2)；

该探针的序列为：

亚洲型舞毒蛾探针AS-TaqMan：FTTGGTAAAGGATTGGATCCCCTCCTCCP(SEQ ID NO.3)或其互补链；

(2)提取亚洲型舞毒蛾DNA；

(3)采用步骤(1)设计的引物和探针进行实时荧光PCR检测。

步骤(2)具体为：取亚洲型舞毒蛾单头虫样放入研钵，加液氮磨成粉末状，用试剂盒提取样品DNA。

步骤(3)中，所述实时荧光PCR检测的反应体系为25μL，包括2×PremixEx Taq 12.5μL，50×ROX Reference Dye0.5μL，步骤(1)设计的上下游引物AS-F/R各1.0μL，AS-TaqMan探针1.0μL，DNA模板2.0μL，超纯水补至25μL。

步骤(3)中，所述实时荧光PCR检测的反应程序为：预变性95℃30sec；然后95℃5sec，60℃34sec循环40次。

在本发明的另一方面，提供一种用于检测亚洲型舞毒蛾的引物，其序列为：

上游引物AS-F：5’-AACTTCAGGATGTCCGAAAAATCA-3’(SEQ ID NO.1)；