[发明专利]JAK2 V617F突变的检测应用

说明书

技术领域

本发明属于核酸检测领域，具体而言，本发明涉及JAK2基因V617F位点脱氧核糖核酸突变(G1849T)的检测以及所用的检测试剂盒和引物对等。

背景技术

Janus kinase 2(本文简称JAK2)属于Janus激酶家族，为胞内酪氨酸蛋白激酶。JAK2自N-端至C-端共由JH7-JH1共7个高度保守的同源结构域(JH1～JH7)组成，通过作用于EPO、TPO、IL-3、G-CSG、GM-CSF受体，起着调控细胞内信号传导、产生细胞增殖效应的作用。然而，JAK2基因14外显子第1849位鸟嘌呤替换为胸腺嘧啶，使位于JAK2蛋白伪激酶区域的第617位苯丙氨酸变异为缬氨酸(JAK2 V617F突变)，将致使伪激酶区域失活，最终导致JAK-STAT、PI3K、AKT等通路出现非细胞因子依赖性激活，从而可能导致骨髓增殖性肿瘤(myeloproliferative neoplasms，MPN)，包括慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)、真性红细胞增多症(polycythemia vera，PV)、原发性血小板增多症(essential thrombocythemia，ET)与原发性骨髓纤维化(primary myelofibrosis，PMF)等。自2008年起，世界卫生组织已在其官方分类诊断标准中将JAK2 V617F突变定义为MPN的分子诊断金标准。(可参见：James C，Ugo V，Le Couédic JP，Staerk J，Delhommeau F，et al.(2005)A unique clonal JAK2 mutation leading to constitutive signalling causes polycythaemia vera.Nature 434：1144；Swerdlow S，Campo E，Harris NL，Jaffe ES，Pileri SA，et al.(2008)WHO Classifcation of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues.WHO Classification of Tumours.4th ed.Lyon，France：IARC)

目前检测该点突变的方法主要是聚合酶链式反应(PCR)后进行测序，但是这一方法中的测序耗时且需要的仪器和试剂成本较高，不适合大规模推广使用。本发明经过长期艰苦的研究，并结合一些筛选的运气，研究出了一对引物并且研究出了配套的方法，可以通过PCR扩增产物的熔解分析而快速获得结果，其中无需耗时的步骤，而且熔解分析仪的维护成本比测序仪要低。由于人群的突变基因的比率很低，实践中一一检测的效率很低，因此往往用多人的混合样品进行检测，更加令人意想不到的是，本发明人研究出来的检测方法能够分辨只含1％(甚至更低)的突变型的样品，而这是测序所无法完成的，因此提高了检测效率。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供新的JAK2 V617F突变的检测应用，该应用比现有技术更深时、成本更低、和/或更高效。另外，本发明还提供了用于这些应用的试剂盒以及引物对等。

具体而言，在第一方面，本发明提供了检测JAK2基因的V617F突变的方法，其包括：

(1)对待检测样品进行PCR扩增，其中使用的引物对序列为：

5’-TGAAGCAGCAAGTATGATGAG-3’，

5’-GGGAGTATGTGTCTGTGGAGACTGACACCTAGCTGTGATCCTG-3’；和

(2)用熔解分析仪进行熔解分析。

在本文中，待检测样品是潜在含有人JAK2基因DNA的离体样品，包括血液、体液或其提纯物。由于人群的突变基因的比率很低，实践中一一检测的效率很低，而本发明人发现，本发明第一方面的方法也能适合混合样品。因此优选在本发明第一方面的方法中，待检测样品是来自不同个体的混合样品。由于是混合样品，结果只能显示混合样品中是否含有突变型基因，但是无法准确判断其中任何一个个体的样品是否含有突变型基因，因此不可能针对个体得出诊断结果，而只能针对混合样品得出检测结果。优选本发明第一方面的方法由上述(1)和(2)组成，即封闭式的方法。这样，更加无法得出针对个体得出诊断结果，而只能得出混合样品中是否含有突变型基因这一非诊断结果。