[发明专利]利用热激和四环素调控的ntCre/LoxP删除系统、重组表达载体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别涉及利用热激和四环素调控的ntCre/LoxP删除系统和应用，还涉及含有ntCre/LoxP删除系统的重组表达载体及其制备方法和应用。

背景技术

在获得转基因中，往往需要转入目的基因，同时为了能将转基因细胞和非转基因细胞分开，还需要引入选择标记基因，选择标记基因一般为抗性基因。一方面，引入的抗性基因会因为基因漂移而带来基因污染，例如形成超级杂草；另一方面，人们担心转基因食品中的抗性基因会影响人类的健康，因此删除转基因植物中的靶基因，特别是抗性基因成为转基因植物研究的热点。

目前主要采用基因删除系统删除转基因植物中的靶基因，主要有Cre/loxP、FLP/FRT、R/RS等位点特异重组系统和转座子删除系统，使用这些删除系统删除抗性基因存在周期长，工作量大，可控性差等问题。大肠杆菌Tn10转座子中的四环素调控系统能够通过四环素调控基因的表达，目前已有将四环素调控系统用于调控真核基因的表达，因此可以应用于调控基因删除系统，但是该系统用于调控真核表达存在表达严密性和适应性问题。植物热激启动子HSP为诱导型启动子，在热激条件下能被激活。拟南芥的热激启动子HSP18.2能够通过控制温度控制下游基因的表达，但是多数热激启动子存在泄漏问题，同时对应用环境要求高，因此用于控制基因删除系统并不理想。理想的删除系统不仅需要具有删除周期短，工作量小，操作简单等特点，还需要具有可控性好，精确度高等优点。

发明内容

本发明目的之一在于提供热激和四环素双重调控系统，通过温度和四环素来调控ntCre重组酶基因表达，表达的ntCre重组酶能够特异识别LoxP位点，从而删除LoxP位点之间核酸序列，具有删除周期短、能够大大减少了工作量、可控性好等优点。

为了实现上述目的，技术方案为：

利用热激和四环素双重调控的ntCre/LoxP删除系统，所述ntCre/LoxP删除系统包括ntCre重组酶特异识别的2个LoxP位点和位于2个LoxP位点之间的靶基因部分，所述2个LoxP位点分别为位于靶基因3’端的第一LoxP位点和位于靶基因5’端的第二LoxP位点；还包括HSF70m启动子调控的Rhsf基因表达盒和Om35S启动子调控的ntCre重组酶基因表达盒部分，所述Om35S启动子由Rhsf基因调控，所述HSF70m启动子核酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述Rhsf基因核酸序列如SEQ ID NO.24所示，所述Om35S启动子核酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述LoxP位点核酸序列如SEQ ID NO.25所示，所述ntCre重组酶基因核酸序列如SEQID NO.26所示。

进一步，所述ntCre/LoxP删除系统是所述第一LoxP位点，靶基因，Om35S启动子调控的ntCre重组酶基因表达盒，HSF70m启动子调控的Rhsf基因表达盒和第二LoxP位点顺序串联。

进一步，所述靶基因为抗性标记基因。

本发明目的之二在于提供含ntCre/LoxP删除系统的重组表达载体，技术方案为：

含有所述ntCre/LoxP删除系统的重组表达载体。

本发明目的之三在于提供重组表达载体的制备方法，技术方案为：

重组表达载体的制备方法，具体步骤如下：将含有HSF70m启动子调控的Rhsf基因表达盒和Om35S启动子调控的ntCre重组酶基因表达盒部分连入pVCT2231载体的酶切位点处；

所述pVCT2231载体由pCAMBIA1320载体、pVCT1191载体和pBIN19载体制备，具体步骤为：从pVCT1191载体中克隆nptIIm基因，并在nptIIm基因3’端加上LoxP位点，获得npt II m-LoxP组件，然后将npt II m-LoxP组件替换pCAMBIA1302载体上的潮霉素抗性基因hptII，并将含LoxP位点的序列反向插入pCAMBIA1302载体，替换pCAMBIA1302载体的35S启动子和mGFP5基因编码区；同时从pBIN19载体中克隆Pnos启动子，替换pCAMBIA1302载体上调控hptII基因的2×35S启动子，即得pVCT2231载体；

所述pVCT1191载体由pCR2.1-TOPO载体改造而来，具体为，删除pCR2.1-TOPO载体上氨苄抗性基因并自环化连接构建的载体，即pVCT1191载体。