[发明专利]大肠埃希菌中mdfA基因的检测引物及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种大肠埃希菌(Escherichia coli，ECO)中耐消毒剂mdfA基因携带情况的检测方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

细菌的外排泵系统可分5类：ATP结合盒转运体家族(ATP-binding cassette family，ABC)、主要易化因子超家族(the major facilitator superfamily，MFS)、药物与代谢物转运体超家族(the much larger drug/metabolite transporter superfamily，DMT)及与之相关的小多药外排家族(the small multidrug resistance family，SMR)、多药物与毒物外排家族(the multidrug and toxic compound extrusion family，MATE)、耐受-生节-分裂家族(the resistance-nodulation-division family，RND)。ABC为能量泵，其余为质子泵。质子泵为细菌通过质子耦联交换产生的质子驱动力(proton motive force，PMF)介导的次级药物(化合物)转运系统。细菌通过此类基因表达对多种化合物(含消毒剂、灭菌剂)的耐药。mdfA编码超广谱外排泵基因，能外排溴化乙锭、结晶紫、普鲁黄和罗丹明等多种抗菌染料。

目前检测mdfA基因携带情况的方法主要有PCR后琼脂糖凝胶电泳、测序。凝胶电泳法成本低、易操作，但灵敏度低，容易出现假阴性；测序是检测基因突变的金标准，但测序技术步骤繁琐、耗时长、容易污染。

发明内容

本发明的目的是提供大肠埃希菌中耐消毒剂mdfA基因携带情况的PCR检测引物及使用该引物的检测方法。

为了达到上述目的，本发明提供了一组大肠埃希菌中mdfA基因的检测引物，其特征在于，包括：

(A).mdfA基因正向引物：5′-ttccctctctgtctggtgct-3′；

(B).mdfA基因反向引物：5′-cccagcagccattgtaaaaa-3′。

本发明还提供了一种大肠埃希菌中mdfA基因的检测方法，其特征在于，采用上述大肠埃希菌中mdfA基因的检测引物，具体步骤为：

第一步：取经培养后鉴定为大肠埃希菌阳性的临床样本分离株，高温灭活，提取样本DNA，作为检测样品；取不携带mdfA基因的大肠埃希菌菌株，高温灭活，提取样本DNA，作为阴性对照品；人工合成mdfA序列，构建携带mdfA基因的重组质粒为阳性对照品；

第二步：用无菌水配制浓度为5-15umol/L的mdfA基因正向引物溶液，浓度为5-15umol/L的mdfA基因反向引物溶液以及浓度为5-15umol/L的mdfA基因检测探针溶液；mdfA基因正向引物的序列为：5′-tccctctctgtctggtgct-3′，mdfA基因反向引物的序列为：5′-ccagcagccattgtaaaaa-3′，mdfA基因检测探针的序列为：FAM-tggcgggcgggatg-MGBNFQ；

第三步：在每一个PCR反应孔中依次加入PCR Master Mix 10-15ul和第二步得到的mdfA基因正向引物溶液0.1-1ul、mdfA基因反向引物溶液0.1-1ul、mdfA基因检测探针溶液0.1-1ul，然后在不同的PCR反应孔中分别加入第一步得到的检测样品、阴性对照品及阳性对照品0.1-1ul，用灭菌重蒸馏水补足25ul；在荧光定量PCR仪上进行反应，反应条件为40-60℃保温1-3分钟，80-100℃保温1-3分钟，再运行30-50个循环，每个循环包括在80-100℃保温10-20秒，再在50-70℃保温0.5-1.5分钟；

第四步：用软件SDS2.2进行结果分析，PCR结果呈S形曲线即为携带mdfA基因。

本发明是对大肠埃希菌中是否还有耐消毒剂mdfA基因的检测，细菌一旦获得此基因即可对现用的消毒剂耐受，使消毒剂失效，通过检测了解细菌中mdfA基因的携带情况，有利于对含有耐消毒剂基因的菌株的监控，防止菌株继续流行，同时从科研角度对其耐药机理的进一步了解还有利于新的灭菌制剂的研制开发。