[发明专利]一种测定酵母蛋白酶A活性的方法

说明书

技术领域

一种测定酵母蛋白酶A活性的方法，属于发酵工程领域。

背景技术

酵母蛋白酶A(EC3.4.23.6)是一种天冬氨酸族蛋白酶，由PEP4基因编码。被分泌到胞外的蛋白酶A可通过降解发酵液和成品啤酒中的泡沫活性蛋白，从而降低纯生啤酒的泡沫稳定性。如何准确测定纯生啤酒中极微量的蛋白酶A一直是研究者所关注的问题。

已有的蛋白酶A检测方法大致可分为两类：利用天然底物测定和利用合成底物测定。天然底物可使用酪蛋白、偶氮酪蛋白、变性血红蛋白、非折叠肌红蛋白、胰岛素A链及B链、核糖核酸酶等，一般使用紫外分光光度法、Lowry法或Bradford法检测。合成底物包括生色肽、荧光肽等，利用底物显色或释放出荧光素来反映蛋白酶A的活性。这些方法或多或少存在一些缺陷，利用天然底物检测灵敏度较低，利用合成底物可以提高检测的灵敏度，但是也存在操作繁琐，或者价格昂贵、底物不易获得等缺点。

近年来新兴的共振散射光谱法(RSS)因其具有灵敏度高、简捷、快速等优点而得到迅猛发展。1975年，Bauer等人通过对二苯基多烯分子吸收体系的光散射的研究，第一次发现了溶液中分子的共振增强瑞利光散射现象。1993年，Pasternack等人利用普通荧光分光光度计建立了共振光散射检测技术，开创了该技术在分析化学中应用的先河，此项技术不仅灵敏度高、选择性好，而且简便易行。在此基础上，1996年，Huang利用α，β，γ，δ-4-(4-三甲基氨苯基)卟啉首次将共振光散射技术应用于核酸浓度的检测。稍后，此项技术又在痕量蛋白质检测中得到应用。在之后的十多年中，共振光散射技术逐渐应用于生化分析、有机分析、环境分析和无机分析等领域。但是，共振光散射技术在酶催化中的应用报道不多，还未见有在测定蛋白酶A酶活方面的报道。由于蛋白酶A对啤酒泡沫的负面影响，严重制约了纯生啤酒的发展。建立一种高效、精确、低廉的酵母蛋白酶A检测方法是迫切需要解决的问题，这将为酵母蛋白酶A的深入研究提供可靠基础，进而推动整个纯生啤酒行业的发展。

本发明利用酪蛋白与三氯乙酸相互作用形成缔合微粒，在468nm处产生较强的共振散射峰，建立了测定酵母蛋白酶A活性的新方法。与现有技术相比，此方法具有快速便捷、检测成本低、检测限低、线性范围宽等优点，各种可能的共存物对测定结果影响不大，并且测定体系可在较长时间内保持稳定。

发明内容

本发明的目的是建立一种快速简便、成本低廉、稳定准确的酵母蛋白酶A活性检测方法，为啤酒厂纯生啤酒泡沫稳定性的预判提供可能，也为蛋白酶A的深入研究奠定基础。

为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：根据三氯乙酸可以与微量蛋白质缔合形成缔合微粒，并且此微粒的浓度在一定条件下与共振散射光强度呈正比关系的原理，用三氯乙酸缔合酵母蛋白酶A与底物酪蛋白反应前后溶液中的蛋白质，测定468nm下的光强，从而可以用酪蛋白的降解量来表示蛋白酶A活性的高低。

具体的操作步骤是：

a.试剂的制备

酪蛋白溶液：0.25g酪蛋白用60mL 6mol/LHCl加热、超声溶解，加Gly-HCl缓冲液，使其终浓度为0.1mol/L，用饱和NaOH溶液调节pH到3，定容到250mL，中速滤纸过滤。

三氯乙酸溶液(2.5mol/L)：408.48g三氯乙酸溶于蒸馏水，定容至1L，过滤。

b.酶液的制备

将150g酵母泥用300mLNa₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液(pH6.5，离子强度1/15mol/L)室温下自溶24小时后，在冰浴中用石英砂研磨自溶液，过滤，离心，取上清液为粗酶液。

纯生啤酒100mL于4℃硫酸铵盐析(50％饱和度)2h，8000r/m离心20min，沉淀用水溶解并定容到50mL，离心取上清液即为粗酶液。

发酵液100mL于4℃硫酸铵盐析(50％饱和度)2h，8000r/m离心20min，沉淀用水溶解并定容到100mL，离心取上清液即为粗酶液。

c.催化反应

在10mL小试管中加入0.1mL粗酶液，再加入0.1％酪蛋白溶液(pH＝3)1mL，混匀，40℃反应20min，加入2mL 2.5mol/L三氯乙酸，加蒸馏水将体系体积补齐到5mL，混匀，缔合20min。

空白为在酶液中先加2mL2.5mol/L的三氯乙酸中止20min后，再加入酪蛋白溶液，加蒸馏水将体系体积补齐到5mL，反应20min。

d.共振光强度测定