[发明专利]一种通过促进活性蛋白聚集体解聚提高淀粉脱支酶产量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种淀粉脱支酶的发酵生产方法，特别是一种通过促进活性蛋白聚集体解聚提高重组淀粉脱支酶胞外分泌的发酵生产方法。

背景技术

淀粉脱支酶(E.C.3.2.1.41)是一类能够水解支链淀粉、α-极限糊精等分子中α-1，6葡萄糖苷键的淀粉水解酶。淀粉脱支酶通常和其它淀粉酶复配用于生产葡萄糖、果糖、麦芽糖、麦芽糊精、低聚糖等产品。淀粉脱支酶可以切断淀粉中的分支点，加速后续酶的反应，缩短反应时间，提高淀粉的转化率，降低其它糖化用酶制剂的使用量，从而达到增加产量、提高设备利用率、降低生产成本的目的。目前能够在最适温度和最适pH上同时实现与糖化酶进行较好配合的商品化淀粉脱支酶主要是美国杰能科公司的Optimax L-1000。我国虽然对淀粉脱支酶进行了大量的研究，但是还没有实现该酶的工业化生产，还需要依赖进口。

近年来国内外学者把淀粉脱支酶的开发研究作为非常重要的研究主题。Bunzo Mikami等对来源于Klebsiella pneumoniae的淀粉脱支酶蛋白晶体结构进行解析，发现该酶具有GH13淀粉水解酶家族共有的(β/α)₈桶状结构。近年来国外学者从极端嗜热微生物中分离出具有可以耐受接近100℃高温的淀粉脱支酶，但是这些酶往往只有在pH 6.0以上才具有较高的活性。R Koch等从Fervidobacterium pennavorans中分离到最适pH在4.5到5.0，而且能够在70℃条件下具有较高稳定性的淀粉脱支酶。国内主要研究了产淀粉脱支酶野生菌的筛选鉴定、重组菌构建、发酵条件优化以及在淀粉原料酶解中的应用。唐宝英等人从土壤中分离出一株产淀粉脱支酶芽孢杆菌，通过诱变和产酶条件优化，酶活从1.6U/mL提高到8.8U/mL，该酶最适反应温度和pH分别为75℃和4.6，在55℃反应条件下，在pH4.0-8.0范围内活性稳定。张明炎等将来源于地衣芽孢杆菌的淀粉脱支酶编码基因克隆大肠杆菌中进行表达，摇瓶发酵产酶最高达到6.5U/mL。苏喆等实现了来源于Thermotoga maritima的淀粉脱支酶编码基因在枯草芽孢杆菌中的成功表达，该酶最适温度90℃，最适pH 6.0，发酵酶活可达89.1U/mL。但是这些菌株的产酶水平仍然较低，生产成本高。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种通过促进活性蛋白聚集体解聚提高淀粉脱支酶产量的方法，以解决现有发酵工艺中胞外酶活较低、生产成本高、无法实现工业化生产的问题。为解决上述问题，本发明的技术方案如下：

(1)重组菌构建

根据NCBI上登录的pulB的基因序列(Genbank号JN872757.1)，采用化学全合成方法合成淀粉脱支酶基因序列pulB。用于构建大肠杆菌表达载体的质粒是pET20b(+)，带有T7启动子。将pET20b(+)质粒和含有pulB基因的质粒分别进行Nco I和HindIII双酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶连接，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，经37℃培养8h，挑转化子在含有100mg/L氨苄青霉素液体的LB中振荡培养，提取质粒，酶切验证得到表达质粒pulB/pET20b(+)。

将质粒pulB/pET20b(+)转化E.coli BL21(DE3)宿主菌，涂布含氨苄青霉素(100mg/L)的LB平板上，37℃培养8h，命名为pulB/pET20b(+)/BL21(DE3)。挑单菌落至液体LB中，37℃培养过夜，保存甘油管。

(2)种子制备

将-80℃甘油管保存的菌株接入种子培养基中，使用回转恒温调速摇床进行培养，控制转速200rpm/min，培养温度37℃，初始pH值7.10，培养时间10小时。

(3)发酵工艺

将活化后的种子培养液接种入发酵培养基中，通过控制搅拌转速和通风量使溶氧维持20-30％，控制温度为30±1℃，流加质量浓度为25％的氨水控制pH 7.0±0.5，培养5-6小时；

待溶氧上升至80-100％，以指数流加的方式补加补料液使溶氧维持在20-30％，温度维持在30±1℃，流加氨水控制pH 7.0±0.5，当菌体OD₆₀₀达到15-30时补加0.75-1.5％(m/V)的甘氨酸；