[发明专利]一种高效发酵生产谷氨酰胺转胺酶酶原的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种高效发酵生产谷氨酰胺转胺酶酶原的方法，特别是一种利用诱导物低温控制策略诱导提高重组Escherichia Coli BL21(DE3)发酵生产pro-TGase(谷氨酰胺转胺酶酶原)的方法。

背景技术

谷氨酰胺转胺酶(Transglutaminase EC 2.3.2.13全称R-glutaminyl-peptide：amine-γ-glutayle-transferase简称TGase)，又称转谷氨酰胺酶或谷胺酰胺酰-肽γ-谷氨酰胺酰基转移酶，具有多种催化功能。它能够通过催化蛋白质分子间或分子内形成ε-(γ-谷氨酰基)赖氨酸共价键，引起蛋白质分子内、分子间发生交联、蛋白质和氨基酸之间的连接以及蛋白质分子内谷氨酰胺基的水解。TGase具有的独特催化功能，使其在许多领域发挥着重要的作用。目前该酶广泛用于食品工业，大量的研究报道来自TGase改善各类食品蛋白质的功能性质和营养价值，应用范围包括肉制品、水产品、乳制品、植物蛋白制品、可食性包装等。通过TGase对食品蛋白的作用机理的研究，人们发现TGase催化蛋白交联表现出一定的底物特异性。对底物蛋白进行一定的变性处理(如化学改性、加热、蛋白酶处理或物理方法)，可使TGase更易接近底物，显著提高酶的催化活性

目前，国内有关TGase的研究主要集中在链霉菌TGase的生产方面，包括筛选野生型产生菌、构建基因工程菌及产酶条件研究和酶的应用等方面。国内除了泰兴一鸣精细化工有限公司有较为成熟的产品外，其他还处于实验室研究阶段。中科院微生物研究所、华南理工大学及本研究室相继开展了TGase重组菌的构建研究。但是对TGase基因工程菌的构建及发酵过程优化仍处于起步阶段。Escherichia Coli作为外源基因表达的宿主，遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，大规模发酵经济，倍受遗传工程专家的重视。目前Escherichia Coli是应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系。在前期研究中，本研究室在分离筛选得到一株TGase高产菌株Streptomyces hygroscopicus的基础上，扩增出编码pro-TGase的基因，并成功表达于Escherichia Coli BL21(DE3)中。此菌株通过摇瓶初步发酵优化后在体外加入蛋白酶活化后酶活最高可达5U/mL，如何提高酶的产量是一个长期困扰我们的问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种高效发酵生产谷氨酰胺转胺酶酶原的方法，以解决谷氨酰胺转胺酶酶原分泌量低的技术问题。

本发明技术方案为：以含有pET22b(+)-proTGase重组质粒的Escherichia Coli BL21(DE3)为生产菌株(The pro-region of Streptomyces hygroscopicus transglutaminase affects its secretionby Escherichia coli，FEMS Microbiology Letters，2011，324，98-105)，从甘油管中接50μL菌液于50mL LB中，过夜8-10h培养后将100mL的种子接入3L全自动发酵罐，搅拌转速为400rpm，培养温度37℃，通气量为1vvm。当菌体浓度OD₆₀₀＝8时，开始加入0.4mM的IPTG并降温至20℃培养诱导pro-TGase的表达。

所述改良TB培养基成分为(g/L)：蛋白胨12，酵母膏24，甘油4-12g/L，17mmol/LKH2PO4，72mmol/L K2HPO4，其中优选TB培养基中，甘油浓度为8g/L。

谷氨酰胺转胺酶酶活测定方法

pro-TGase的活化

活化蛋白酶(dispase，12mg/mL)：0.86mg dispase溶于500μL标准活化缓冲液(50mMTris-HCl，300mM NaCl，2mM CaCl₂，1mM GSH，pH 7.0)。活化过程：将4uL活化蛋白酶添加至100uL pro-TGase溶液中，37℃温育2h。活化胞外pro-TGase时，13,000r/min离心5min，取上清液即可进行活化过程。活化胞内pro-TGase时，取5OD₆₀₀样品离心，沉淀用500μL50mmol/L Tris-HCl pH 8.0重悬。超声破碎后，13,000r/min离心5min，取上清液进行活化。