[发明专利]一株产阿泊拉霉素的工程菌及其应用

说明书

技术领域

本发明属于抗生素制药领域，涉及一种工程菌及其应用，具体地说，本发明涉及一株产阿泊拉霉素的工程菌及其应用。 

背景技术

黑暗链霉菌（Streptomyces tenebrarius）是1967年美国礼莱公司研究人员从土壤中分离得到，该菌株能产生一组抗生素，称之为暗霉素复合物（Nebramycins），组分2：阿泊拉霉素、组分4：氨甲酰卡那霉素B和组分5：氨甲酰妥布霉素三个组分为主组分，在对各个因子进行生物学研究时发现这三个组分均有良好的抗菌作用，且都是重要的原料药。其中，阿泊拉霉素是一种对猪痢疾以及沙门氏菌病有效的畜用氨基糖苷类抗生素。阿泊拉霉素含有独特的辛二糖结构，对多种氨基糖苷钝化酶具有灭活作用，对氨基糖环上不同位置修饰后所得的衍生物，可增加母体的抗菌活性，是黑暗链霉菌产生的特色化合物。 

目前，阿泊拉霉素的生产是从黑暗链霉菌发酵液中层析分离而得。由于暗霉素三个组分理化性质相近，要从发酵液中对该三种组分进行逐一分离，不但层析分离周期长，收率低，料耗大，污染严重，工艺复杂，而且产品质量不稳定。因此，长期困扰企业生产，阻碍了企业产品生产技术的升级换代，成了产业化生产的技术瓶颈，结果是生产成本高，环境污染严重，价格居高不下。 

若能获得主产阿泊拉霉素的稳定菌，则以上所有问题将迎刃而解，其所带来的直接经济效益，间接社会效益和环境效益等是极其巨大的，更重要的是给清洁生产，安全用药，提供了可靠保障。 

  

发明内容

    本发明的目的在于提供一株主产阿泊拉霉素的工程菌及其应用。 

本发明提供的一株产阿泊拉霉素的工程菌，所述工程菌为黑暗链霉菌（Streptomyces tenebrarius）T103，已于2011年11月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No. 5516。所述黑暗链霉菌（Streptomyces tenebrarius）T103是通过灭活妥布霉素生物合成基因簇中tobS1-C基因功能，且不产生氨甲酰妥布霉素。 

本发明还提供了所述工程菌的发酵方法，具体方法为：菌株T103发酵前先用稀释平板法分离出产孢丰富的单菌落转接于斜面培养基，37℃培养3—7d，挖块接种于种子培养基，37℃摇床培养18 h，转速为180-350rpm；然后按1-10%接种量转接于发酵培养基，37℃摇床培养120 h，转速为250rpm；所述种子培养基：葡萄糖1-5g，玉米淀粉10-20g，黄豆饼粉5-30g，磷酸二氢钾0.5-1.0g，氯化钾1-5g，氯化钙0. 25-5.0g，硫酸镁0.5-5.0g，加自来水至1L；发酵培养基：葡萄糖10-30g，玉米粉10-30g，黄豆饼粉10-35g，硫酸镁1.0-11g，碳酸钙1-7g，鱼粉4-8g，硫酸锌0.1-0.5g，硫酸铵1-7g，玉米淀粉10-50g，淀粉酶0.01-0.50g，加自来水至1L，用氢氧化钠溶液调节pH至7.0-7.2。 

优选地，所述种子培养基：葡萄糖5g，玉米淀粉10g，黄豆饼粉15g，磷酸二氢钾0.5g，氯化钾1g，氯化钙0.25g，硫酸镁5g，加自来水至1L；所述发酵培养基：葡萄糖15g，玉米粉20g，黄豆饼粉35g，硫酸镁11g，碳酸钙7g，鱼粉6g，硫酸锌0.1g，硫酸铵7g，玉米淀粉20g，淀粉酶0.5g，加自来水至1L，用氢氧化钠溶液调节pH至7.0-7.2。 

本发明还提供了所述的工程菌在制备抗菌药物中的应用。 

    菌株T103的筛选，主要包括以下几个步骤： 

A.    tobS1-C基因置换质粒的构建；

B.     置换质粒转化黑暗链霉菌；

C.     转化子的筛选；

D.    工程菌代谢产物组分的鉴定。

    基因置换的方法是，采用PCR法分别获得tobS1-C基因上下游长度约1000bp的片段，作为同源交换臂，将两者同时连接到穿梭载体上，如pKC1139等，交换臂外插入红霉素抗性等基因，如ermE，作为筛选标记，便于黑暗链霉菌DNA重组后工程菌的筛选，最终得到置换质粒pSH6（图1）。