[发明专利]用于诊断草鱼呼肠孤病毒的三重PCR检测引物组、试剂盒及方法

权利要求书

1.草鱼呼肠孤病毒的三重PCR检测引物组，由以下3对引物组成：

引物对1

P01-F：5' GCC ACC TTT GAG CGC GAG AC 3'(SEQ ID NO：1)；

P01-R：5' GTT AGG GCG GAA AGC ATA CCA GA 3'(SEQ ID NO：2)；

引物对2

P02-F：5' GCT GAT GCT GCA GAC GGC TAA AC 3'(SEQ ID NO：3)；

P02-R：5' TAA TTG CCT GCT GCG CTG ACT 3'(SEQ ID NO：4)；

引物对3

P03-F：5' GGC GGC ATG AAT ATG TAT CGA CT 3'(SEQ ID NO：5)；

P03-R：5' TAT GTG ATT ACG CGG GTC AG 3' (SEQ ID NO：6)。

2.草鱼呼肠孤病毒的三重PCR检测试剂盒，包括引物液、Tap DNA聚合酶、PCR buffer、dNTP混合物，所述引物液含有权利要求1所述的引物组。

3.草鱼呼肠孤病毒的三重PCR检测方法，包括如下步骤：

1）提取待检组织总RNA；

2）对待检样品总RNA进行逆转录反应；

3）将权力要求1所述引物组中的三对引物按等物质的量比例混合后加入PCR反应体系中，以反转录产物cDNA为模板，进行PCR扩增反应；

4）根据PCR扩增结果判断待检样品是否感染草鱼呼肠孤病毒及判断病毒的基因型。

4.根据权力要求3所述的检测方法，其特征在于，所述PCR反应体系为25μL，包括权利要求1所述的引物组，其中每条引物（SEQ ID NO:1~6）的终浓度均为1pmol/μL，2.5μL 10×PCR buffer，5U Tap DNA聚合酶，终浓度各为0.1mM的dNTP混合物，用10μL反转录产物cDNA作为模板，用水补至25μL。

5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，PCR扩增反应程序为：95℃℃预变性5min，94℃变性30s，53.6℃退火30s，72℃延伸40s，循环30次，72℃延伸10min。