[发明专利]利用固定化运动发酵单胞菌催化菊粉果糖和木薯葡萄糖生产高浓度山梨醇和葡萄糖酸的方法

权利要求书

1.一种利用固定化运动发酵单胞菌同时催化菊粉果糖和木薯葡萄糖生产高浓度山梨醇和葡萄糖酸的方法，其特征在于，具体步骤为

(1)高浓度等摩尔的菊粉果糖和木薯葡萄糖混合水解液的酶法制备；

首先，将质量浓度为50％的菊粉在60℃、pH4.0、糖化酶酶量1U/g菊粉的条件下酶解48小时，然后加入已在90℃液化1小时的木薯淀粉，在60℃、pH4.0的条件下继续水解12小时，获得等摩尔浓度的果糖和葡萄糖的混合水解液；

(2)重组运动发酵单胞菌的细胞固定化；

将表达有葡萄糖果糖氧化还原酶的运动发酵单胞菌在不通气、30℃、pH6.0、150rpm、接种量10％(v/v)的条件下培养18小时后，离心获得湿细胞并用超纯水悬浮至150g/L。然后将12.5％(w/v)的聚乙烯醇溶液和0.125％(w/v)的海藻酸钠溶液加热溶解，冷却至室温后与细胞悬浮液混合，其中PVA溶液和细胞溶液体积比4∶1，将混合溶液在磁力搅拌作用下充分混匀1小时；然后，将混合溶液通过蠕动泵滴加到饱和硼酸溶液中，并搅拌3小时；使固定化的细胞颗粒平均直径为4毫米，并用去离子水清洗以除去颗粒表面的硼酸溶液，即得到固定化的运动发酵单胞菌细胞；

(3)利用固定化运动发酵单胞菌同时催化果糖和葡萄糖获得含有高浓度山梨醇和葡萄糖酸的混合液；

在反应器中加入制备好的混合水解液和固定化的运动发酵单胞菌细胞，在pH 6.4、温度39℃、150rpm的条件下进行催化，得到含有高浓度山梨醇和葡萄糖酸的混合液；每次催化结束后，进行固液分离，液体进行下一步的山梨醇和葡萄糖酸的分离和纯化，固体细胞颗粒则多次循环用于催化反应。

2.如权利要求1所述的一种利用固定化运动发酵单胞菌同时催化菊粉果糖和木薯葡萄糖生产高浓度山梨醇和葡萄糖酸的方法，其特征在于，在所述的步骤(1)中，用于酶解菊粉的糖化酶是混合型商业糖化酶，该酶液中含有糖化酶和菊粉酶和多种酶蛋白，但所述的酶液不限于商业糖化酶，还包括糖化酶和菊粉酶混合液。

3.如权利要求1所述的一种利用固定化运动发酵单胞菌同时催化菊粉果糖和木薯葡萄糖生产高浓度山梨醇和葡萄糖酸的方法，其特征在于，在所述的步骤(2)中，所述的重组运动发酵单胞菌为表达有葡萄糖果糖氧化还原酶的运动发酵单胞菌，其葡萄糖果糖氧化还原酶酶活比野生菌中的高出2倍。

4.如权利要求1所述的一种利用固定化运动发酵单胞菌同时催化菊粉果糖和木薯葡萄糖生产高浓度山梨醇和葡萄糖酸的方法，其特征在于，在所述的步骤(2)中，用于固定运动发酵单胞菌的溶液为12.5％(w/v)的PVA和0.125％(w/v)的海藻酸钠的混合溶液；PVA和海藻酸钠较为合适的质量比为10∶1。

5.如权利要求1所述的一种利用固定化运动发酵单胞菌同时催化菊粉果糖和木薯葡萄糖生产高浓度山梨醇和葡萄糖酸的方法，其特征在于，在所述的步骤(3)中，初始果糖和葡萄糖的总糖浓度500g/L，即果糖和葡萄糖浓度各为250g/L，在此高糖浓度下可以抑制乙醇的产生。细胞浓度则选择10g/L。

6.如权利要求1所述的一种利用固定化运动发酵单胞菌同时催化菊粉果糖和木薯葡萄糖生产高浓度山梨醇和葡萄糖酸的方法，其特征在于，在所述的步骤(3)中，每一次转化结束后，对反应体系进行固液分离，液体进行山梨醇和葡萄糖酸的产品分离，固定化的细胞颗粒则留在反应器中，重新加入新鲜的水解液，进行下一次催化过程，整个过程固定化细胞可以进行1-4次循环催化反应。