[发明专利]筛选肿瘤早期诊断靶标的Small RNA-Seq库的构建方法

权利要求书

1.一种针对单一个体的小量血样构建二代测序Small RNA-Seq库的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

步骤1).血浆分离操作：

对新鲜血液样本，利用冷冻离心机，4℃从血液内分两步分离血浆，第一步：400g～600g离心8～15分钟，收集上清以去除血细胞；第二步：1500g～2000g离心8～15分钟，收集上清以充分去除细胞碎片；

步骤2).总RNA提取取；

对步骤1所获得的血浆样本，使用TRIZOL抽提3-4次以去除蛋白，抽提完成后加入异丙醇和肝糖，-80℃沉淀过夜，乙醇洗涤沉淀后用无核酸酶污染的双蒸水重悬沉淀，并进一步浓缩该RNA溶液；

步骤3).3’adapter和5’adapter连接：

3’adapter连接：在步骤2)获得的总RNA中加入热激后的3’Adapter和连接试剂，于PCR仪上孵育连接；

在连按反应获得的溶液中加入RTprimer，于PCR仪上孵育；

5’adapter连接：热激后的5’Adapter与上步反应获得的溶液混匀加入相应的连接试剂，置于PCR仪上，孵育连接；

利用RNA浓缩法去除溶液中的连接缓冲液、多余的盐离子等，得到与5’和3’Adapter连接的RNA；

步骤4).反转录合成cDNA与PCR扩增：

反转录：在PCR管中加入来自步骤3)与5和3’Adapter连接的RNA和相应的反转录试剂，混匀，置于PCR仪上，孵育获得cDNA片段，并用PCR扩增所获得的DNA片段

步骤5).电泳及胶回收：

使用TBE-PAGE胶电泳上述步骤4)获得的DNA片段，将片段大小在140bp左右的DNA片段切下，并回收其中的DNA，获得的DNA片段即可用于目的样本中的samll RNA的建库与进一步的检测分析。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述的血液样本为来源于单一个体的8ml新鲜血液样本，每8ml样本可分离的血浆量为4ml。

3.根所权利要求1-2任一所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述的TRIZOL抽提步骤为：对血浆样本加入相应体积的TRIZOL，混匀后静置，然后加入氯仿，混匀后静置，离心分离上清；经浓缩后，每4ml步骤1)所获得的血浆最终浓缩为4.6μl RNA溶液。

4.根据权利要求1-3任一所述的制备方法，其特征在于，步骤3)所述3’Adapter连接时，来自步骤2)的4.6μl总RNA中加入1μl浓度为0.25nM的3’Adapter，使用PCR仪孵育，温度22℃，时间2h；步骤3)所述加入RT primer后的孵育步骤是：70℃5min，37℃30min，25℃15min；步骤3)所述的5’Adapter连接时，向之前获得的连接溶液中加入1μl浓度为0.25nM的5Adapter，使用PCR仪孵育，温度20℃，时间1h。

5.根所权利要求1-4任一所述的制备方法，其特征在于，步骤4)中所述的PCR反应步骤是：PCR仪首先预热至65℃以上，首先95℃，5min；然后95℃10s、60℃30s、72℃30s循环18次；最后72℃孵育10min。

6.权利要求1-5任一所述的建库方法用于制备针对特异性疾病的诊断试剂盒的应用。

7.由权利要求1-5任一所述的建库方法获得的针对特异性疾病的诊断试剂盒。