[发明专利]实时监测蛋白水解酶活性的指示剂的制备方法及应用方法

权利要求书

1.实时监测蛋白水解酶的指示剂的制备方法，用于实时监测蛋白水解酶活性的工具为由荧光蛋白改造而成的蛋白水解酶活性指示剂（PAI），其特征在于该指示剂的制备方法是：对荧光蛋白进行循环置换，用蛋白水解酶识别序列将N端和C端连接改变它们的空间结构，同时产生新的N端和C端，经循环置换后的荧光蛋白即为蛋白水解酶活性指示剂（PAI），PAI没有荧光，在经相应的蛋白水解酶作用后，PAI变成由荧光蛋白的N端和C端两部分肽段组成，这两部分经荧光互补产生荧光，PAI能由基因直接编码。

2.根据权利要求1所述的实时监测蛋白水解酶的指示剂的制备方法，其特征在于该指示剂的具体制备步骤如下：

（1）将荧光蛋白游离的N端与C端通过分子生物学技术缩短，但保证荧光蛋白发荧光的功能，产生的N端和C端命名为N₁和C₁；

（2）在荧光蛋白内部的某位点将肽键切断，形成新的游离的N端与C端，命名为N₂和C₂；

（3）用蛋白水解酶识别位点（较短的多肽序列）连接缩短后的荧光蛋白的N₁端与C₁端，构成一个完整的蛋白，该蛋白即为蛋白水解酶活性指示剂，Protease Activity Indicator，命名为：PAI。

3.根据权利要求1所述的实时监测蛋白水解酶的指示剂的制备方法，其特征在于：以Venus为基础生产的用于监测蛋白水解酶Caspase-3活性的蛋白水解酶活性指示剂（PAI-C3）的cDNA（基因）：

   该基因对应编码的氨基酸序列为：

划单下划线的序列编码Venus荧光蛋白的C端多肽；划双下划线的序列编码Venus荧光蛋白的N端多肽；中间的序列编码Caspase-3水解酶的识别和水解位点（DEVDG）。

4.根据权利要求3所述的实时监测蛋白水解酶的指示剂的制备方法，其特征在于：此处荧光蛋白的C端和N端可替换为其它具有β-桶装结构的荧光蛋白；Caspase-3的水解位点可替换为其它水解蛋白：Caspase-1—Caspase13、Trypsin、HIV-1 Protease、site-1 Protease。

5.实时监测蛋白水解酶的指示剂的应用方法，其特征在于该应用方法包括以下步骤：

（1）构建质粒：

（a）将荧光蛋白游离的N端与C端通过分子生物学技术缩短，保证荧光蛋白功能较短序列，最短最好，但不是必须的；

（b）在荧光蛋白的某特定位点，在EGFP及其衍生的荧光蛋白的不限与此的第154与155残基之间，将其切断，形成N端与C端两部分多肽片段；

          （c）连接缩短后的N端与C端，同时插入某一蛋白水解酶的识别位点，使两个多肽成为一个完整的蛋白，即为蛋白水解酶活性的指示剂（PAI）；

           （d）将表达以上指示剂（PAI）的cDNA连接到合适的载体上，构建完整质粒，用于在生命体系中表达；

（2）在体内或体外通过指示剂（PAI）荧光的有无强弱的变化，监测蛋白水解酶活性的变化。

6.根据权利要求3所述的实时监测蛋白水解酶的指示剂的制备方法，其特征在于：以权利要求3中所述的基因（cDNA）为基础衍生的各种表达载体制备成的监测蛋白水解酶活性的试剂或试剂盒。

7.根据权利要求2所述的实时监测蛋白水解酶的指示剂的制备方法，其特征在于：以权利要求4中所述的PAI为基础生产的监测蛋白水解酶活性的试剂或试剂盒。