[发明专利]小鼠皮肤黑色素细胞特异表达的载体及其应用

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，具体而言涉及一种在皮肤黑色素中特异表达，从而为产生转基因动物提供高效表达的载体。

背景技术

CDK5-A是CDK家族成员，研究表明CDK5-A通过调节羊驼黑色素细胞产生黑色素的路径上TYR和MC1R等基因的表达，参与羊驼毛色形成，并在其表型和功能的维持中起重要的作用。为了将羊驼CDK5-A转入绒山羊使其毛色表型发生变化成为可能，载体中承载的可表达序列(包含启动子、报告基因、FLAG标签以及目标基因)的构建是前提。

该构建技术主要应用DNA重组技术定向地将不同的DNA片段进行连接，在特定的受体细胞中与载体同时复制进行表达，从而产生新的目的遗传性状。该构建的目的是将CDK5-A基因接入真核表达载体中，通过自身携带的特异启动子以及在哺乳动物细胞内表达的真核启动子使目的基因在特异细胞中表达。在设计该构建时根据目的而对所涉及的DNA片段进行修饰和改造。

构建转基因小鼠的表达载体，理想的应该是带内含子的基因组DNA，可是，由于一般基因组DNA都比较长，获取完整而又正确的序列非常困难，所以一般情况下用的是cDNA。而且，制备转基因载体构建时，首先必须将导入DNA进行分离纯化，并线性化。而在使用的载体上除了多克隆位点之外，还有很多其它酶切位点的，故用限制性内切酶进行酶切可以使DNA线性化。另外，还可以通过在设计的引物上额外加上限制性内切酶酶切位点，也可以解决该问题。

为了体现目标基因是否进行表达，在载体上需要一个报告基因，这样报告基因的一个优点是它可以区分转录体是来源于转染的质粒还是来源于内源性基因。同时，报告基因常含有一个Kozak一致序列(即该序列含有真核生物翻译起始密码子)，并在下游含有多聚A信号，因此在RNA聚合酶II作用下产生的mRNA能翻译为蛋白质。报告基因编码区的上游插入了启动子，是DNA分子报告基因的mRNA、蛋白质或酶水平可以反应启动子的活性。

对于细胞特异性启动子而言，启动子活性在表达的细胞系中与其在非表达的细胞系中具有很大差异，因此，为了使构建在特异的细胞中表达，选择细胞内特异的启动子是必要的。

目的基因在特异细胞中表达后，为了分析蛋白质的生物学功能以及筛选目的基因暂时不容易得到或特异细胞转染效率低的基因靶点，常在氨基端加一FLAG标签。Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK)，一般不与目的蛋白发生相互作用，并且不会影响目的蛋白的生物活性和细胞内定位，这样利于对其进行下游研究。

发明内容

本发明为了提高CDK5在黑色素细胞中的表达效率，构建了含有CDK5的载体。为了实现本发明的目的，本发明采用如下的技术方案：

本发明一方面涉及一种载体，其序列结构为pMD18-T-TYRP2-CDK5-SV40intron/polyA，优选的，其含有SEQ ID：7的DNA序列。

本发明另一方面还涉及一种试剂盒，其含有上述载体，优选的，在本发明的试剂盒中还包括辅助基因转染的试剂。

本发明另外一方面还涉及制备上述载体的试剂盒，其包括SEQ ID：1-6的引物。

本发明另一方面还涉及上述载体的用途，其特征在于所述的载体用于体外黑色素细胞的转染。

另一方面，本发明还涉及上述载体在调节动物黑色素表达中的应用，所述的应用是非治疗目的的。

具体实施方式

(1)克隆小鼠TYRP2基因的启动子片段

以小鼠基因组DNA为模板，PCR法扩增获得，经纯化后，进行TA克隆。

所用引物如下：

Try2P-F(SEQ ID：1)：5’CGAGCTCGTAAATGCACACATCTGCATGC 3’ (Sac I)

Try2P-R(SEQ ID：2)：5’GCCCGGGGCCGGCGTCCCACCTGGTTTC 3’  (Xma I)

(2)克隆羊驼CDK5 cDNA片段，并带有FLAG标签

以羊驼cDNA为模板，引物中设计FLAG序列，PCR法扩增获得，经纯化后，进行TA克隆。

所用引物如下：

CDK5-Kozak-F(SEQ ID：3)：5’GCCCGGGGCCGCCACCATGCAGAAATACGAGAAACTGG 3’(Xma I)