[发明专利]志贺样毒素Stx1B口服疫苗的制备方法及其产品

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，特别涉及志贺样毒素Stx1B口服疫苗的制备方法及制得的Stx1B口服疫苗。

背景技术

大肠杆菌（Escherichia coli）O157 ：H7是肠出血性大肠埃希菌的一个血清型，大肠杆菌O157：H7感染后能产生毒素使vero细胞死亡，产生的毒素志贺样毒素 ( Stx)，主要作用于猪或者人的结肠和回肠细胞，感染猪后的主要症状是猪水肿病。Stx 包含有1 个A 亚单位和5 个B 亚单位，组成了A-5B 结构的复合毒素。其中A 亚单位是Stx 的毒力单位，它具有RNA-N 端糖苷酶的活性，能够干扰细胞内蛋白质的合成，导致细胞损伤死亡。而B 亚单位是无毒性的， 但能与具有特定受体(Gb3) 的细胞结合，产生特异性抗体，再与A 亚单位结合发挥作用。由于志贺样毒素B亚基（简称为Stx1B）不具有致病性，又能有效的诱导免疫应答，因此Stx1B可以作为理想的疫苗，用于预防大肠杆菌O157 ：H7感染。

大肠杆菌O157 ：H7主要入侵途径是消化道，因此注射免疫途径的疫苗往往不能有效诱导肠道内的特异免疫反应，但是使用没有经过特殊的处理口服疫苗抗原而直接进行口服免疫时，能够有效到达肠道并激起肠道内淋巴系统特异反应的抗原量太低，也不能有效诱导肠道内的免疫反应。因此，急需一种口服疫苗的制备方法，制得的疫苗能够到达肠道并能激起肠道特异免疫反应的，可以用于预防大肠杆菌O157 ：H7感染。

发明内容

  本发明目的之一在于提供志贺样毒素Stx1B口服疫苗的制备方法，其制备方法简单，成本低。

为实现上述目的，技术方案为：

志贺样毒素Stx1B口服疫苗的制备方法，具体步骤如下：

（1）克隆志贺样毒素Stx1B基因

根据大肠杆菌O157 ：H7志贺样毒素Stx1B基因序列设计上游引物和下游引物，再提取大肠杆菌O157 ：H7基因组DNA，并以提取的基因组DNA为模板，用设计的上游引物和下游引物进行PCR扩增，得志贺样毒素Stx1B基因；

（2）构建含Stx1B基因的重组表达载体

将步骤（1）所得的志贺样毒素Stx1B基因进行酶切，并将志贺样毒素Stx1B基因连入经同样酶切的双元表达载体，得含Stx1B基因的重组表达载体；

（3）制备志贺样毒素Stx1B口服疫苗

将步骤（2）所得重组表达载体转化农杆菌，得含重组表达载体的农杆菌，将制得的含重组表达载体的农杆菌用于转化植物细胞，经诱导，筛选，鉴定，得转基植株，收集转基因植株，干燥，粉碎，得志贺样毒素Stx1B口服疫苗。

进一步，所述步骤（1）中，所述上游引物核酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步，所述步骤（2）是用限制性内切酶BamH I和SacⅠ酶切步骤（1）所得志贺样毒素Stx1B基因，同时用BamH I和SacⅠ酶切双元表达载体，将回收的Stx1B基因与酶切后的双元表达载体连接。 

进一步，所述双元载体为改良pCAMBA1301载体。

进一步，所述步骤（3）中，所述农杆菌为EHA105。

进一步，所述植物细胞为烟草细胞。

本发明目的之二在于提供制得的志贺样毒素Stx1B口服疫苗，

由所述制备方法制得的志贺样毒素Stx1B口服疫苗。

本发明的有益效果在于：本发明公开的志贺样毒素Stx1B口服疫苗的制备方法，方法简单，通过常规的植物转基因方法即能制得，可以通过转基因植物的繁殖获得大量的志贺样毒素Stx1B口服疫苗，烟草还具有生长快，产量高的特点，因此生产成本低，产量高；制得的志贺样毒素Stx1B位于植物细胞内，植物细胞的细胞壁具有与“胶囊”相似功能，对表达的志贺样毒素Stx1B蛋白在胃中具有保护作用，因此本发明公开的志贺样毒素Stx1B口服疫苗不需要经过特殊处理，可以直接添加到饲料中进行口服免疫；口服免疫后志贺样毒素Stx1B在细胞壁的保护下在胃中进行初步消化，然后进入小肠，与小肠中具有特定受体(Gb3) 的细胞结合，进而作为抗原诱导免疫应答，产生抗体，达到预防大肠杆菌O157：H7感染的效果；使用口服疫苗具有免疫成本低，免疫途径简单，免疫效果可靠的特点，便于疫苗的推广；经志贺样毒素Stx1B口服疫苗免疫后能够有效预防大肠杆菌O157：H7感染，降低猪水肿病的发病率，同时降低死亡效率。

附图说明