[发明专利]一种延长苹果组培苗继代间隔时间的方法

说明书

技术领域

 本发明涉及一种利用组织培养技术进行苹果种质资源离体保存的方法。

背景技术

随着人口数量急剧增长，不合理开垦荒地，大面积毁林，加之工业污染，环境生态平衡遭到严重破坏，一些珍贵、稀有物种面临灭绝或濒于绝种。同时由于植物育种技术的发展，人工选择及良种的推广，品种构成单一化现象日趋明显，致使许多有益的珍贵种质资源丢失。因此，植物种质资源保存已成为全球性关注的课题。

植物种质资源保存的主要手段有两种，一是原境保存，即建立自然保护区就地保护濒危植物；二是在异境建立田间种质基因库或离体保存等。原境保存和异境建立田间种质基因库需要大量的土地和人力资源，成本高，易遭受各种自然灾害的侵袭和病虫危害，也不便于种质资源交流。

离体保存种质资源是将植物外植体在无菌环境下进行组织培养保存，可克服常规田间保存法的缺点，不占用土地、节省贮存空间、免去日常管理、便于运输和交流等。自1975年Henshaw和Morel首次提出离体保存植物种质的策略以来，该项技术受到国际植物界的极度重视，1982年，国际植物遗传资源委员会专门成立了离体保存咨询委员会，许多国家相继建立了植物种质离体基因库。

在组织培养保存种质的过程中，由于培养基营养耗尽、水分蒸发，每隔一段时间，要将培养物及时转移接种到新培养基中，以保证培养物正常生长。苹果组培苗一般2个月左右继代一次，需要花费人力、物力，同时由于培养材料长期受外源激素的刺激，继代次数越多，发生变异的几率也会越大。随着离体培养技术的全面展开，以之为基础的限制生长法离体保存技术也得到了应用。限制生长保存法，即在组培苗继代保存过程中，通过调控培养物生长的外界条件，使材料生长降至最小限度，营养消耗减少，从而延长继代间隔时间，减少继代次数，既大大节省试管苗继代接种的工作量，又降低变异机率，保持种质的遗传稳定性。

 

发明内容

本发明建立了一种延长苹果组培苗继代间隔时间的方法，为利用组织培养技术进行苹果种质资源的离体保存提供技术支撑。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：将苹果组培苗培养基略作延缓生长调整，接种后经一段时间的缓苗生长，由常规25±3℃的培养条件改为8±1℃左右的低温条件，有效抑制试管苗生长；通过试验，筛选出适宜的组培苗封口材料，解决冷藏箱内湿度大、易长霉菌污染的问题，延长苹果组培苗的保存时间。

本发明的具体内容，即延长苹果组培苗继代间隔时间的具体方法步骤如下：

（1）制备继代培养基：MS+BA0.5~0.75mg/L+NAA0.05mg/L+白砂糖40.0g/L+琼脂6.0g/L，培养基灭菌前调节pH6.0；为节省占用空间，培养容器采用50ml三角瓶，每瓶培养基分装量要多于常规组培繁殖时培养基的分装量，一般掌握1L培养基分装30~35瓶左右；由于冰箱密封严、湿度大，组织培养常用的棉塞加牛皮纸的封口材料很容易发霉长菌，要使用组培专用封口膜，可有效解决污染问题，还能比棉塞更好地抑制培养基水分蒸发。

（2）将苹果组培苗接入培养基中，在25±3℃，光照强度2000lx，光照时间10-14h/d的培养条件下缓苗生长2周左右，这样可保证组培苗进入健壮生长状态。

（3）将缓苗后的组培苗放入2-8℃药品贮存箱延缓生长，使用该冷藏箱，有如下优点：容量大，有多层搁架，并能调整间隙，可贮存的组培苗数量多；透明真空玻璃门可提供组培苗生长所需的散射光，如果全黑暗条件，组培苗几乎没有叶片、茎细弱，不利于下次继代接种及恢复生长，同时玻璃门也便于观察组培苗的生长情况；箱外有大屏幕数字温度显示，并有超温报警功能，高性能循环风机，使箱内温度稳定、均匀。实际应用时观察，冷藏箱放满组培苗后温度一般在8±1℃ 。

（4）延缓生长的组培苗一般可保持15-18个月，茎尖存活率90%以上，待发现培养基接近干枯，可从冷藏箱拿出，在培养室常规条件恢复生长1-2周，或直接接入新的培养基。

本发明专利的有益效果是，通过改变培养容器的封口材料，解决了湿度大、易污染问题，可将苹果组培苗放入冷藏箱，有效减缓了组培苗生长，减少了营养消耗和培养基水分蒸发，成功地将苹果组培苗的继代间隔时间由2个月延长至15-18个月，大大减少了继代接种的工作量，也降低了变异几率。该技术应用于苹果以及其它部分木本果树和花卉组培苗种质保存，简单、方便、节约、有效，为种质资源保存提供了新途径。

 

附图说明

图1为缓苗生长后的苹果组培苗即将放入冷藏箱。