[发明专利]一种结核分枝杆菌耐多药检测方法

权利要求书

1.一种结核分枝杆菌耐多药检测方法，其步骤是：

A、建立MTB临床菌株和H₃₇Rv标准菌株的PCR模板；

B、设计与异烟肼和利福平耐药密切相关katG、inhA和rpoB基因片段的三对引物，同时对临床菌株的katG、inhA和rpoB基因进行mPCR扩增；并对临床菌株和H₃₇Rv标准菌株的的katG、inhA和rpoB基因分别进行PCR扩增；

C、采用单链构象多态性检测方法同时检测临床菌株耐INH和RFP相关的3个基因的突变情况；

所述步骤B中的mPCR引物以及PCR引物是：扩增katG基因的上、下游引物分别为5’-AAG GAA GCC ACC TGG CTC GGC-3’以及5’-GCC GAA CGG GTC CGG GAT GGT-3’，扩增产物预期的大小为510bp；扩增inhA基因的上、下游引物分别为5’-GGC ATC CAC ATC TCG GCG-3’以及5’-CAG CGC GCA CAC CGT CTT GGC-3’，扩增产物预期的大小为381bp；扩增rpoB基因的上、下游引物分别为5’-ACA TCC GGC CGG TGG TCG CCG-3’以及5’-TTT CGA TCG GGC ACA TCC GGC-3’，扩增产物预期的大小为207bp。

2.根据权利要求1所述的一种结核分枝杆菌耐多药检测方法，其特征在于所述mPCR扩增的反应体系为：PCR总体积100μL，内含2.5mol/L dNTP、katG、inhA和rpoB基因的各自上、下游引物250mmol/L、2.5UEx-TaqDNA聚合酶、2μL模板、pH8.3的1×PCR缓冲液。

3.根据权利要求2所述的一种结核分枝杆菌耐多药检测方法，其特征在于所述mPCR扩增的参数为：94℃4min；94℃30s、52℃30s、72℃45s，循环35轮；72℃5min；采用1μg/mL溴乙锭预染2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

4.根据权利要求2或3所述的一种结核分枝杆菌耐多药检测方法，其特征在于所述单链构象多态性检测方法是：将上述mPCR产物以及结核分枝杆菌H₃₇Rv标准菌株katG、inhA和rpoB基因的PCR产物各10μL分别与等体积变性剂混合，沸水浴5min后冰浴2min，5000r/min4℃离心2min，取水相加入8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上样孔，13℃400V电泳5min后120V电泳10h，然后取胶板进行银染法染色，观察结果；若单链位置与H37Rv标准菌株单链位置不同，称为运动变位，判定为基因突变。

5.根据权利要求4所述的一种结核分枝杆菌耐多药检测方法，其特征在于所述PCR扩增的反应体系中只加katG、inhA或rpoB基因的各自上、下游引物250mmol/L，反应体系其它成分以及PCR参数与mPCR相同。

6.根据权利要求5所述的一种结核分枝杆菌耐多药检测方法，其特征在于：还对MTB临床菌株和H₃₇Rv标准菌株的katG、inhA和rpoB基因分别进行DNA直接测序，然后对测序结果进行比较，验证单链构象多态性检测方法的可靠性；

对MTB临床菌株进行DNA测序时设置H37Rv株作标准对照；临床菌株与H37Rv株的katG、inhA或rpoB基因扩增片段分别用PCR产物纯化试剂盒提纯、回收后，测序。

7.根据权利要求6所述的一种结核分枝杆菌耐多药检测方法，其特征在于还对MTB临床菌株和H₃₇Rv标准菌株进行药物敏感试验，根据药敏结果判定标准，测定结核分枝杆菌临床菌株对异烟肼和利福平耐药性；

所述药物敏感试验是：采用绝对浓度法检测MTB临床菌株对INH和RFP的耐药性，实验中以对INH和RFP敏感的H₃₇Rv标准菌株为质控菌株，药物浓度为低高两个浓度，INH为1和10μg/mL，RFP为50和250μg/mL，实验重复三次以确保结果正确；

所述药敏结果判定标准是：在无药对照培养基上被检菌株生长良好时，含药培养基斜面无菌落生长为敏感；菌落生长占斜面面积1/4为耐药1+；菌落生长占斜面面积1/2耐药2+；菌落生长占斜面面积3/4为耐药3+。低浓度含药培养基菌落生长1+以上提示耐药。