[发明专利]一种提高酿酒酵母分泌表达异源蛋白的方法及专用酿酒酵母菌株

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高酵母分泌表达异源蛋白的方法，尤其是针对分子量大且二硫键丰富的异源蛋白的方法及专用提高酿酒酵母异源蛋白分泌表达的菌株。

背景技术

近年来，以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为宿主菌表达异源蛋白日益引起重视，酿酒酵母作为低等真核生物具有非致病性，快速分裂，容易培养，基因操作简单等优势，并且具备将异源蛋白进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，然而，仍然存在很多瓶颈如低分泌效率和过度糖基化等，制约了异源蛋白在酿酒酵母中的分泌表达。影响异源蛋白分泌效率的主要因素有：目的蛋白本身的性质，密码子偏好性，载体，启动子，信号肽，蛋白质合成、折叠和分泌过程，受体菌和培养条件(Niebauer RT and Robinson AS，In：Baneyx F(ed)Protein expression technologies.Horizon，Norwich；2005：253-296.)。在这些影响因素中蛋白质合成、折叠和分泌过程有可能是限速步骤。在内质网腔中，分子伴侣和助折叠因子促进蛋白质加工折叠成正确的结构，是限速步骤之一，有研究报道过表达内质网分子伴侣或者非折叠应答途径(UPR)的组分可以促进蛋白分泌(Ji L et a1.，Bioresour Technol 2011，102(17)：8105-8109；Ilmén M et al.，Biotechnol Biofuels 2011，4：30)。另外一个限速步骤是蛋白质运输过程，有许多研究结果表明敲除介导高尔基体到囊泡的蛋白质误分拣途径的囊泡蛋白分拣受体Sc-VPS10基因，可以促进异源蛋白分泌(Hong E et al.，J Cell Biol 1996，135：623-633；Holkeri H and Makarow M，FEBS Lett 1998，429：162-166；Zhang B et al.，J Cell Biol 2001，153：1187-1198)；另外过表达参与高尔基体产生的分泌小泡与质膜融合的t-SNARE基因Sc-SSO1，可以提高异源蛋白分泌表达(Ruohonen L et al.，Yeast 1997，13(4)：337-351；Larsson S et al.，Appl Environ Microbiol 2001，67(3)：1163-1170)。

纤维素乙醇是有潜力的未来燃料，纤维素乙醇的生产需要纤维素水解微生物和糖发酵微生物的协作。CBP(Consolidated bioprocessing)是将纤维素酶和半纤维素酶生产、纤维素水解和乙醇发酵过程组合或部分组合，通过一种微生物完成。CBP过程有利于降低生物转化过程的成本，越来越受到研究者的普遍关注。一个成功的CBP菌株不仅需要强有力的乙醇发酵能力，还需要纤维素水解能力。作为传统的乙醇生产菌株，酿酒酵母被认为是良好的CBP载体(Lynd LR et al.，Microbiol Mol Biol Rev 2002，66(3)：506-577.)。构建酿酒酵母CBP菌株的主要策略是在酿酒酵母中高效分泌表达木质纤维素水解酶(Lynd et al.，Microbiol Mol BiolRev 2002，66(3)：506-577)。