[发明专利]来自丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶的突变体和使用该突变体制备PLA或PLA共聚物的方法

说明书

本申请为“来自丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶的突变体和使用该突变体制备PLA或PLA共聚物的方法”发明专利申请的分案申请，母案的国家申请号为“200880102864.7”、PCT国际申请日为2008年7月25日、PCT国际申请号为PCT/KR2008/004348。 

技术领域

本发明涉及一种来自丙酸梭菌(Clostridium propionicum)的丙酰辅酶A转移酶的突变体，其能够在使用微生物制备聚乳酸酯(PLA)或PLA共聚物的方法中高效地将乳酸酯转化成乳酰辅酶A。 

背景技术

聚乳酸酯(PLA)是一种源自乳酸酯的常见生物可降解聚合物，其极大地应用于商业和生物医学领域中。目前，虽然PLA的制备涉及微生物发酵制得的乳酸酯的聚合，但是通过乳酸酯的直接聚合仅仅制得具有大约1000～5000道尔顿的低分子量的PLA。为了合成具有100,000道尔顿以上分子量的PLA，可以使用链偶联剂聚合由乳酸酯的直接聚合制得的具有低分子量的PLA。然而，在该方法中，由于不容易除去的有机溶剂或链偶联剂的加入，使整个过程变得复杂。目前，制备高分子量PLA的商业上可用的方法可包括将乳酸酯转化成交酯并利用交酯环的开环缩聚作用合成PLA。 

在通过乳酸酯的化学合成来合成PLA时，PLA均聚物容易获得，但是由多种类型的单体组成的PLA共聚物难以合成并且是商业上无法利用的。 

同时，聚羟基链烷酸酯(PHA)是一种在如磷(P)、氮(N)、镁(Mg)和氧(O)等的其它营养物质缺乏而碳源过量时由微生物储藏作为能量或碳源的聚酯。 由于PHA与通常来自石油的合成聚合物具有相似的物理性质，并且呈现出完全的生物降解性，所以其被认为是常规合成塑料的替代品。 

为了使用微生物生产PHA，需要将微生物代谢产物转化成PHA单体的酶和使用PHA单体合成PHA聚合物的PHA合酶。当使用微生物合成PLA和PLA共聚物时，需要相同的体系，并且除了用于提供羟酰辅酶A(其为PHA合酶的最初底物)的酶以外，还需要用于提供乳酰辅酶A的酶。 

因此，为了提供乳酰辅酶A，本发明人使用来自丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶和来自假单胞菌属(Pseudomonas)sp.6-19的使用丙酰辅酶A转移酶作为底物的PHA合酶的突变体，由此如在韩国专利申请第10-2006-0116234中所公开的那样能够成功地合成PLA和PLA共聚物。 

然而，已报道，当用非常强的启动子在大肠杆菌中高表达来自丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶(作为用于提供乳酰辅酶A的酶)时，会出现严重的代谢紊乱，由此抑制细胞生长(Selmer等人在Eur.J.Biochem.269：372，2002中报道)。此外，因为编码来自丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶的基因的密码子选择与大肠杆菌的完全不同，所以正常表达丙酰辅酶A转移酶会是非常困难的。因此，为了比常规系统更加有效地合成PLA和PLA共聚物，非常重要的是，引入平稳地提供乳酰辅酶A并且在不会极大地抑制细胞生长的情况下充分表达的丙酰辅酶A转移酶。 

发明内容

技术问题 

本发明旨在一种通过提供能够有效地供应乳酰辅酶A的提供单体的酶而高效地制备聚乳酸酯(PLA)或PLA共聚物的方法。 

技术方案 

本发明人发现，在使用来自丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶的突变体时，通过在不会极大地抑制细胞生长的情况下有效地提供乳酰辅酶A而可以高效 地制备PLA或PLA共聚物。这一发现致使他们完成本发明。 

因此，本发明提供了一种用作提供乳酰辅酶A的酶的丙酰辅酶A转移酶的突变体和编码该突变体的基因，该突变体具有其中突变为T78C、T669C、A1125G和T1158C的SEQ ID NO：3的基因序列。 

本发明还提供了一种用作提供乳酰辅酶A的酶的丙酰辅酶A转移酶的突变体和编码该突变体的基因，该突变体具有其中突变为A1200G的SEQ ID NO：3的基因序列。 

本发明还提供了一种用作提供乳酰辅酶A的酶的丙酰辅酶A转移酶的突变体和编码该突变体的基因，该突变体具有其中突变为A1200G的SEQ ID NO：3的基因序列和其中突变为Gly335Asp的对应于SEQ ID NO：3的氨基酸序列。