[发明专利]从胎盘中分离间充质干细胞的方法

权利要求书

1.从胎盘中分离间充质干细胞的方法，该方法包括以下步骤：

(a)取胎盘小叶，用PBS缓冲液充分冲洗，以去除胎盘中残留的血液；

(b)将胎盘小叶剪成块状，加入含有组织消化酶的PBS缓冲液，再在37℃孵育消化；

(c)将组织块用铜网过滤，必要时研磨以促使过滤；

(d)将收集的过滤液离心，分离单个核细胞，再用MSC培养基悬浮所获得的细胞，然后在37℃、5％CO₂培养箱中培养；

(e)待散在细胞形成克隆后，挑取各克隆细胞，用MSC培养基分别培养，待细胞融合后，用胰酶消化传代，即得胎盘间充质干细胞；

以及任选的下列一个或多个步骤：

(f)针对步骤(e)所得胎盘间充质干细胞，检测以下项目的至少一项：细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型；

(g)将步骤(e)所得传代后的胎盘间充质干细胞于液氮中冻存；

(h)建立包含以上信息的胎盘干细胞的数据库，并使该数据库与步骤(g)的冻存细胞进行关联。

2.根据权利要求1的方法，其中所述步骤(a)是在产后四小时之内，在无菌条件下将胎盘小叶剪下，用含10％体积胎牛血清(FBS)的PBS缓冲液充分冲洗胎盘小叶去除胎盘小叶中残留的血液。

3.根据权利要求1的方法，其中所述步骤(b)中的组织消化酶是选自下列的一种或多种：dispase、胰酶、脱氧核糖核酸酶I(DNase I)、胶原酶IV、透明质酸酶。

4.根据权利要求1的方法，在步骤(b)中，在37℃孵育10～30分钟，优选10～20分钟，例如10分钟、15分钟或20分钟。

5.根据权利要求1的方法，在步骤(d)中，所述MSC培养基是含10％FBS的PBS缓冲液。

6.根据权利要求1的方法，在步骤(e)中，待散在细胞形成克隆后，挑取各克隆细胞，用MSC培养基分别培养，待细胞60～90％融合后，用胰酶消化传代，即得胎盘间充质干细胞。

7.根据权利要求1的方法，在步骤(f)中，所述细胞污染检测是利用病原学方法，检测细胞是否受到选自下列的一项或多项的感染：乙肝两对半、丙肝、艾滋病毒、巨细胞病毒、EB病毒和梅毒、HbsAg、HbsAb、HBcAb、HbeAg、HbeAb、HCVAb、HIV-1/2Ab、CMV-IgM和EBV-IgA、TRUST。

8.根据权利要求1的方法，在步骤(h)中，所述数据库中包括与所保存的细胞所有相关的数据，包括：细胞的生物学特性检测结果、多向分化潜能鉴定结果、细胞分子遗传学诊断结果、胎儿及其父母的详细资料。

9.根据权利要求1至9任一项的方法，其中所获得的胎盘间充质干细胞的细胞纯度大于95％。

10.一种胎盘间充质干细胞，其是根据权利要求1-9任一项的方法获得的。