[发明专利]一株分泌表达瑞氏木霉外切葡聚糖酶I的重组酿酒酵母菌株及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一株分泌表达瑞氏木霉外切葡聚糖酶I Tr-Cel7A的重组酿酒酵母菌株及其在CBP酵母研究和以纤维素为原料的化工产品生产中的应用。

背景技术

纤维素乙醇是有潜力的未来燃料，纤维素乙醇的生产需要纤维素水解微生物和糖发酵微生物的协作。CBP(Consolidated bioprocessing)是将纤维素酶和半纤维素酶生产、纤维素水解和乙醇发酵过程组合或部分组合，通过一种微生物完成。CBP过程有利于降低生物转化过程的成本，越来越受到研究者的普遍关注。一个成功的CBP菌株不仅需要强有力的乙醇发酵能力，还需要纤维素水解能力。作为传统的乙醇生产菌株，酿酒酵母被认为是良好的CBP载体(Lynd LR et al.，Microbiol Mol Biol Rev 2002，66(3)：506-577.)。构建酿酒酵母CBP菌株的主要策略是在酿酒酵母中高效分泌表达木质纤维素水解酶(Lynd et al.，Microbiol Mol Biol Rev 2002，66(3)：506-577)。

纤维素降解至少需要三种，内切葡聚糖酶(或称1，4-β-D-葡聚糖-葡聚糖水解酶，EC 32.1.4，通常用EG来代表)和外切葡聚糖酶(包括1，4-β-D-葡聚糖-纤维二糖水解酶，EC 32.1.91，用CBH来代表，和1，4-β-D-葡聚糖-葡萄糖水解酶，EC 3.2.1.74)和β-葡萄糖苷酶(或称为纤维二糖酶，β-葡萄糖苷-葡萄糖水解酶，EC 3.2.1.21，常用BGL来代表)(Karl-Erik Eriksson et al.，In：Springer series in wood science.Berlin/Heidelberg，New York：Springer-Verlag；1990.)。内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶协同作用产生纤维二糖和一些纤维寡糖，进而β-葡萄糖苷酶水解产生葡萄糖，其中，外切葡聚糖酶对降解微晶纤维素是必需的。

丝状真菌瑞氏木霉Trichoderma reesei是最强大的纤维素酶生产菌株之一，瑞氏木霉纤维素酶系统至少由两种外切葡聚糖酶、至少六种内切葡聚糖酶和两种β-葡萄糖苷酶组成，其中Tr-Cel7A(CBH I)是瑞氏木霉产生的主要纤维素酶，可以水解固体纤维素，并占瑞氏木霉所分泌纤维素酶的60％(Nidetzky B and Claeyssens M，Biotechnol Bioeng 1994，44：961-966；J，1991，PhD Thesis，Uppsala University，Sweden)，据文献报道Tr-Cel7A从纤维素的还原端连续水解纤维素链(Barr B Hsieh et al.，Biochemistry 1996，35(2)：586-592；Divne C et al.，J Mol Biol 1998，275(2)：309-325；Nutt A et al.，Eur J Biochem 1998，258(1)：200-206.)。Tr-Cel7A含有513个AA(Shoemaker S et al.，Biotechnology(N.Y.)1983，1：691-696)，在催化结构域有10个二硫键，在底物结合结构域含有2个二硫键(Guochao Wu et al.，World J Microbiol Biotechnol 2010，26：323-328.)，另外在催化结构域还含有4个潜在的N-糖基化位点，蛋白质相对分子量偏大，结构相对比较复杂，这就为其在酿酒酵母中异源表达增加了难度。

目前，在酿酒酵母中成功实现Tr-Cel7A异源分泌表达的报道不多，ME等(ME et al.，Gene 1988，63(1)：103-112.)在酿酒酵母中实现了Tr-Cel7A的异源分泌表达，但重组Tr-Cel7A被过度糖基化修饰；同样Den Haan R等(Den Haan R et al.，Enzyme Microb Tech 2007，40：1291-1299.)在酿酒酵母中异源分泌表达的Tr-Cel7A也同样被过度糖基化修饰，Tr-Cel7A酶活仅为10mU g^-1DW。在酿酒酵母中分泌表达异源白，除了过度糖基化修饰外，蛋白质低分泌效率也同样是限制性因素，要获得良好的CBP酵母，需要提高Tr-Cel7A的分泌表达量以及酶活性。

发明内容

针对现有技术不足，本发明要解决的问题是提供一株瑞氏木霉外切葡聚糖酶ITr-Cel7A分泌表达水平较高的重组酿酒酵母菌株及其在CBP酵母研究和以纤维素为原料的化工产品生产中的应用。