[发明专利]提高富马酸产量的基因工程菌株及构建方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，涉及一种提高富马酸产量的基因工程菌株及构建方法及其应用。

背景技术

富马酸是一种重要的基本化工原料和精细化工产品，广泛用于涂料、树脂、医药、增塑剂等领域。工业上可用于生产不饱和树脂和醇酸树脂，以及用作生产电泳漆的原料。与苯乙烯的共聚物是生产玻璃钢的原料，与乙酸乙烯的共聚物是优良的粘合剂。食品级富马酸是口味纯正的酸味剂，用作饮料、酒类、糕点以及腌菜等的酸味剂，并起着食品防腐剂、抗氧化剂和pH调节剂的作用。将富马酸与碳酸钠反应制备的富马酸钠是一种食品添加剂的风味增强剂；饲料级富马酸及其酸类能提高饲料中有机物质的吸收率和生物学利用率，减少机体能量消耗，所以还具有促进增重等作用。同时，以富马酸为原料可以进一步合成多种高价值衍生物。富马酸和醇类在硫酸催化剂的作用下进行酯化反应可生成富马酸酯，近代已开发出一系列的富马酸酯类防霉防蛀剂，如富马酸二甲酯(DMF)、二乙酯(DEF)、二丙酯(DPF)、二丁酯(DBF)、单甲酯(MMF)等，其代表性产品富马酸二甲酯为国外八十年代开发的一类低毒、高效、价廉、广谱的新型防霉防腐剂，较苯甲酸、山梨酸、脱氢醋酸、丙酸及相应的盐具有用量少、成本低、效果好等优点，国外早已广泛应用于食品防霉剂行业。以富马酸作为原料，可以进一步合成多种药品，富马酸钠与硫酸亚铁的置换产物富马酸亚铁已广泛应用于医学上治疗人体的小红血球贫血病，其他诸如富马酸奎地平，富马酸酮替芬，富马酸氯马斯汀片，富马酸比索洛尔片剂等都已在国内外上市使用。另外，富马酸作为一种重要的四碳平台化合物，还可以通过酶催化转化、酯化、加氢等工艺生产L-天冬氨酸、苹果酸、琥珀酸、马来酸、1，4-丁二醇、γ-丁内酯和四氢呋喃等四碳化合物。微生物发酵法制备富马酸的常用菌种为米根霉、少根霉、无根根霉以及黑根霉，Tsao教授等报道了利用米根霉发酵产富马酸(Appl Environ Microbiol，1996，62：2926～2931.)，通过对米根霉合成富马酸代谢途经分析，葡萄糖通过糖酵解过程生成丙酮酸，丙酮酸在经TCA和反TCA途径生成富马酸的同时，还可在乳酸脱氢酶(LDH)的作用下生成乳酸，乳酸途径的存在大大削弱了富马酸的积累能力。研究人员尝试通过菌株诱变手段筛选乳酸缺陷型菌株，但一直受限于低筛选效率和筛选方法不恰当等限制因素的制约，未能获得遗传稳定的低产乳酸米根霉菌株。米根霉在经历了一定时间的常规培养后，ldhL在产物积累中渐渐起到主导作用，从而使得米根霉积累乳酸的能力逐步提高，严重影响了富马酸的合成。因此通过某种技术手段阻断ldhL基因将改变碳代谢流的分配，减弱或完全剔除乳酸代谢支路，从而达到提高富马酸代谢通量的目的。而如何有效抑制ldhL活性以及在代谢迁移的基础上，进行代谢流调控，重新分配代谢通量，将是实现利用基因敲除技术改造R.oryzae高通量积累富马酸的关键。

发明内容：

本发明的目的是提供一种提高富马酸产量的基因工程菌株。

本发明另一个目的是提供一种提高富马酸产量的基因工程菌株的构建方法。

本发明的第三个目的是提供一种提高富马酸产量的基因工程菌株的用途。

本发明的技术方案概述如下：

一种提高富马酸产量的基因工程菌株的构建方法，包括如下步骤：

(1)乳酸脱氢酶基因ldhL的克隆：

以提取的米根霉细胞基因组DNA为模板，分别以序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2为上、下游引物，进行PCR反应，扩增出SEQ ID No.5所示的乳酸脱氢酶ldhL基因序列，提纯，将提纯后的乳酸脱氢酶ldhL基因序列与pMD18-simple-T载体连接，得到重组pMD18-simple-T载体，进行序列测定，酶切所述重组pMD18-simple-T载体，得到包含酶切位点的ldhL基因片段；

(2)包含真菌启动子序列、反向ldhL基因序列以及终止子序列的重组片段构建：

利用Not I，Xho I将步骤(1)获得的片段反向插入到SEQ ID No.7所示的质粒pGAPZB启动子的下游，获得重组质粒pGAPZB-ldhL，用Bgl II，BamH I酶切重组质粒所述pGAPZB-ldhL，得到包含真菌启动子序列、反向ldhL基因序列以及终止子序列AOX1的重组片段pGAP-ldhL-AOX1；

(3)潮霉素抗性基因的克隆：