[发明专利]人LOX-1细胞外结构域的高效可溶性表达及纯化方法

权利要求书

1.一种人LOX-1细胞外结构域的高效可溶性表达方法，包括以下步骤：

（1）表达载体的构建

表达载体中使用麦芽糖结合蛋白(MBP)作为融合标签；根据目的蛋白的二级结构及其pI值的特性在目的蛋白N末端添加蛋白酶酶切位点；采用gateway连接技术构建表达质粒；

（2）表达条件的优化

使用大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)作为表达宿主细胞；通过培养条件及IPTG浓度变化控制表达速度；

（3）hLOX-1 ECD蛋白的纯化

利用MBPTrap HP回收融合蛋白，通过蛋白酶酶切除去融合蛋白中的MBP标签，分子筛、离子交换层析等交替使用得到在SDS-PAGE上为单一条带的高纯度hLOX-1 ECD蛋白。

2. 一种人LOX-1细胞外结构域的高效可溶性表达方法，包括以下步骤：

表达载体的构建

选择hLOX-1 ECD结构域为表达对象；利用PCR反应从人LOX-1 cDNA中扩增hLOX-1 ECD基因片段；采用Gateway技术将目的基因同表达载体进行连接；

1）以人LOX-1 cDNA作为模板，设计引物：

引物1：5’-caccCTGGTGCCACGCGGTTCTTCCCAGGTGTCTGACCTCC-3’

引物2：5’-tcattaCTGTGCTCTTAGGTTTGCCTTC-3’

进行PCR反应，扩增出hLOX-1 ECD基因片段；

2）构建重组克隆质粒pENTR-thr-hLOX-1 ECD，将其转化到Top10感受态细胞中，分离含有pEhLOX-1E质粒的大肠杆菌并培养扩增, 回收pEhLOX-1E质粒；

3）向带有MBP融合标签的表达载体pDEST-Mal中插入hLOX-1 ECD基因片段；质粒pEhLOX-1E和pDEST-Mal连接，将反应产物转入大肠杆菌DH5α，用含有氨苄青霉素的平板筛选含有表达载体pDEST-Mal-thr-hLOX-1 ECD的大肠杆菌，并进行扩大培养、提取pDMhLOX-1E质粒、测序验证插入的hLOX-1 ECD基因序列的正确性；

表达条件的优化

1）用大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)作为表达宿主细胞，将质粒pDMhLOX-1E通过化学转化法转入宿主细胞中，保存含有质粒pDMhLOX-1E的大肠杆菌备用；

2）高效表达条件的建立：

①初始培养温度为30-37度；

②诱导培养温度为20-35度；

③IPTG浓度为100-500微摩尔之间；

④开始诱导时的菌体浓度（以OD₆₀₀时的吸光度为浓度计算参数）OD₆₀₀ = 0.4-0.6；

hLOX-1 ECD蛋白的纯化

将菌体悬浮在生理缓冲液中，采用超声法破碎细胞；将细胞碎片等沉淀物质除去，回收上清液进入分离纯化工序：

⑴ 使用MBPtrap HP亲和层析柱回收可溶的融合蛋白，操作规程依据MBPtrap HP的使用说明书所记述的操作规程；缓冲液为上述的缓冲液A和B，回收含有融合蛋白的组分；

⑵ 将融合蛋白通过制备型分子筛进行纯化，收集目的蛋白峰；使用缓冲液C进行洗脱，设定洗脱流速为1.5 ml/min；

⑶ 用凝血酶切开标签蛋白MBP同hLOX-1 ECD蛋白的连接，用MBPtrap HP柱除去MBP蛋白，回收含有hLOX-1 ECD蛋白的组分；

⑷ 采用阴离子和阳离子交换树脂连续交替处理，进一步纯化hLOX-1 ECD蛋白；使用缓冲液D和E，设定梯度洗脱流速为1.5 ml/min；回收纯化后的hLOX-1 ECD蛋白；

⑸ 进一步分子筛纯化，得到高纯度活性hLOX-1 ECD蛋白。