[发明专利]检测结核分枝杆菌分泌蛋白的免疫层析试纸及其制备方法

权利要求书

1.一种快速检测结核分枝杆菌的免疫层析试纸，其特征是：包括上样垫(1)、含有金标记的抗CFP-10单克隆抗体TBCA6的胶体金垫(2)、包被质控线(3)和检测线(6)的硝酸纤维素膜(5)、吸样垫(4)以及支撑板(7)；所述检测线(6)为包被在硝酸纤维素膜上的抗CFP-10单克隆抗体TBCD6，质控线(3)为包被在硝酸纤维素膜(5)上的羊抗鼠IgG抗体；在硝酸纤维素膜(5)的上表面分别设置胶体金垫(2)和吸样垫(4)，上样垫(1)位于胶体金垫(2)的上表面，硝酸纤维素膜(5)的下表面与支撑板(7)固定相连。

2.如权利要求1所述的快速检测结核分枝杆菌的免疫层析试纸的制备方法，其特征是包括以下步骤：

A、抗CFP-10单克隆抗体TBCD6和TBCA6的制备：

用于包被检测线(6)的抗CFP-10单克隆抗体TBCD6，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：C201082；

用于胶体金垫(2)中金标记的抗CFP-10单克隆抗体TBCA6，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：C201083；

制备方法如下：

1)单抗腹水的诱导：在接种杂交瘤细胞前一周，给BALB/C小鼠腹腔注射降植烷每只0.5ml，然后每只接种5×10⁶TBCD6或TBCA6的阳性杂交瘤细胞，10天后收集腹水离心，测定抗体效价；

2)TBCD6或TBCA6单克隆抗体的纯化：利用Protein G亲和纯化法分别纯化腹水中的TBCD6或TBCA6单克隆抗体；

B、制作包被检测线(6)和质控线(3)的硝酸纤维素膜(5)；然后将包被检测线(6)和质控线(3)的硝酸纤维素膜(5)粘贴在支撑板(7)上；

包被检测线(6)和质控线(3)的硝酸纤维素膜(5)制作方法依次进行如下步骤：

1)、用0.01mol/L PH7.4磷酸盐PBS缓冲液将抗CFP-10单克隆抗体TBCD6配制成浓度为0.3mg/ml的溶液，用喷膜仪在硝酸纤维素膜(5)的下表面以0.8～1.2ul/cm的参数划线，包被成检测线(6)；

2)、用0.01mol/L PH7.4磷酸盐PBS缓冲液将羊抗鼠IgG抗体配制成2.4mg/ml的溶液，用喷膜仪在硝酸纤维素膜(5)的上表面以0.8～1.2ul/cm的参数划线，包被成质控线(3)；

3)将划线后的硝酸纤维素膜(5)于36.5～37.5℃的温度和小于30％的湿度的条件下干燥8～10小时；得包被检测线(6)和质控线(3)的硝酸纤维素膜(5)；

C、制备含有金标记的抗CFP-10单克隆抗体TBCA6的胶体金垫(2)：

将TBCA6单克隆抗体胶体金探针溶液加入至玻璃纤维膜或聚脂膜，干燥后，得胶体金垫(2)；将胶体金垫(2)粘贴在步骤B得到的硝酸纤维素膜(5)的上表面的左侧；

所述TBCA6单克隆抗体胶体金探针溶液的制备方法如下：

1)、将质量浓度0.01％的HAuCL₄水溶液加热煮沸，每50ml HAuCL₄水溶液在100-110℃的磁力加热搅拌下加入1.7～1.8ml的质量浓度1％的柠檬酸三钠水溶液，于100-110℃继续加热搅拌8～12分钟，得胶体金溶液；

2)、调节胶体金溶液至pH5.5，将抗体TBCA6按0.7～0.75mg抗体TBCA6/100ml胶体金溶液的比例偶联，混匀后为TBCA6的免疫胶体金探针溶液；

3)、将上述TBCA6的免疫胶体金探针溶液4℃15000r/min离心30min后弃去上清，以重悬液重悬沉淀物，得TBCA6单克隆抗体胶体金探针溶液；所述重悬液是步骤2)的胶体金溶液体积的0.9～1.2倍；

所述重悬液的制备方法如下：在浓度为0.01mol/L，PH7.4的PB缓冲液一升中加入9～11g的BSA、33～37g的蔗糖和0.28～0.32g的PEG20000；

D、在步骤C所得的胶体金垫(2)的上表面粘贴上样垫(1)；在硝酸纤维素膜(5)的上表面的右侧搭接吸样垫(4)，得快速检测结核分枝杆菌的免疫层析试纸。

3.根据权利要求2所述的快速检测结核分枝杆菌的免疫层析试纸的制备方法，其特征是所述步骤C中：将TBCA6单克隆抗体胶体金探针溶液按1ml溶液铺23～27cm²的比例均匀地铺在玻璃纤维膜或聚酯纤维膜上。