[发明专利]基于核酸适配子的肝癌诊断试剂盒

说明书

技术领域

本项发明属医学诊断技术领域。 

背景技术

原发性肝癌（下称肝癌）是常见恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年上升趋势。近年来肝癌的治疗手段有了长足的进步，但是5年生存率仍不理想。据国内大样本多中心临床资料统计显示，住院肝癌患者的5年生存率只有32.5%，晚期肝癌1年生存率仅14.7%，3年生存率为0.3%，5年生存率为0，而早期肝癌患者及时治疗后，1、3、5 年生存率分别达到93.5 %、70.1 %和59.1 %。因此，尽早诊断并尽早治疗是目前改善肝癌患者预后最有效的手段，探索并建立有效的肝癌诊断新技术具有十分重要的意义。 

目前影像学检查是肝癌定位诊断的主要手段，血清标志物检测是肝癌定性诊断主要的手段。影像学诊断肝癌后，还需要进一步检测肝癌血清标志物进行印证，对于像影学诊断困难的小肝癌，标志物检测是唯一的无创性诊断手段。甲胎蛋白（AFP）是目前全世界应用最广泛的肝癌血清标志物，已经用了数十年，但其敏感性（40%~65%）、特异性（76%~96%）并不理想。因此，寻找更加敏感、更加特异的肝癌诊断新方法一直是各国学者的研究热点。 

核酸适配子（aptamer）是一种生物靶分子的人工单链寡核苷酸配体，通过SELEX（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）技术从随机单链寡核苷酸文库中筛选获得。核酸适配子筛选的基本步骤如下：设计并合成随机单链寡核苷酸文库；将文库与靶标共孵育，使文库中能与靶标特异性结合的寡核苷酸与靶标形成复合物，分离复合物并洗脱寡核苷酸，以洗脱的寡核苷酸为模板进行PCR扩增，制备成新的单链随机寡核苷酸文库，开始下一轮筛选；重复数轮孵育-分离-扩增，与靶标高特异性和高亲和力结合的核酸序列将留在文库中并被指数富集；对最后一轮筛选后制备的文库进行克隆、测序，长度及两端序列与文库相符的单链寡核苷酸序列即为核酸适配子；测定各核酸适配子与靶标结合的特异性和亲和力，选出能高特异性和高亲和力结合靶标者，即可应用于靶标的检测分析。 

核酸适配子的功能与抗体类似，但与抗体相比具有许多优点：①高特异性和高亲和力：核酸适配子能够分辨出靶分子结构上的细微差别，亲和力可强于天然配体；②靶标广泛：从有机小分子、生物大分子到病毒颗粒、完整细胞等均可作为筛选核酸适配子的靶标；③稳定性好：核酸适配子可长期保存，人工合成而无批间差异，可在常温下运输；④改建和修饰容易：可在核酸适配子的特定部位进行精确的标记、修饰或核苷酸替换；⑤应用优势：核酸适配子无免疫原性，可在体内反复使用；分子小，方便于体内影像诊断和治疗。 

核酸适配子在人类疾病的诊断方面显示出良好的应用前景。Golden等用核酸适配子检测碱性成纤维生长因子（bFGF），其敏感性高于商业化ELISA试剂盒近20倍，且特异性良好。Liu等用核酸适配子纳米传感器可以快速、敏感、特异地检出循环血液中的肿瘤细胞。McCauley等研制出核酸适配子传感器阵列，能特异且定量检测出与血清或细胞提取物混合的3种肿瘤标志物。Hicke等用放射性核素标记黏韧素-C的核酸适配子，成功应用于人胶质母细胞瘤和乳腺癌动物模型的肿瘤显像。 

外周血标本具有易采集、侵入性小、易重复等优点，是目前疾病的临床诊断中应用最广泛的检材。筛选肝癌血清特异的核酸适配子，籍于其在诊断应用方面的优势，建立更为特异和敏感的以血清标本为检材的肝癌诊断方法，研发出基于核酸适配子的肝癌诊断试剂盒，应用于肝癌的临床诊断，对于提高肝癌的诊疗水平具有十分重要的价值。 

发明内容

本发明的目的：研发一种以核酸适配子为探针、血清为标本的肝癌诊断试剂盒，为肝癌的临床诊断、疗效评估和预后判断提供新方法。 

本发明采用的技术方案：通过SELEX技术筛选肝癌血清特异性核酸适配子，采用常规聚丙烯酰胺凝胶电泳及灰度测定方法进行基于核酸适配子的血清分析，优选出诊断肝癌敏感性和特异性俱佳的核酸适配子，采用正交试验进一步优化实验条件，最终研发出基于核酸适配子的肝癌诊断试剂盒。